完整大鼠背根神经节的全细胞膜片钳记录

摘要

来源：Gong, K.,等. 成年大鼠完整背根神经节的膜片钳记录. J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了利用膜片钳技术测量背根神经节中感觉神经元的兴奋性，通过测定阈电流（rheobase）和膜电位，并分析神经元对逐步增加的电流注入所产生的反应。

方案

所有涉及动物样本的操作均已被相应的动物伦理审查委员会审核并批准。 

1. 膜片钳记录

1. 将电极液（见表1）置于冰上，以防止降解。用滤纸过滤的细胞内液（注射器滤器，孔径：0.2 µm）填充玻璃膜片电极，并将电极插入放大器头部的电极夹持器中。在将电极浸入浴液之前，通过5 ml注射器推动活塞约1 ml，对电极施加轻微的正压。
   注意：这可以防止电极堵塞。
2. 旋转放大器上的模式旋钮，选择“V-clamp”模式，然后在软件中打开“膜测试”界面。在显微镜下观察，将电极移至目标神经元附近。
   注意：在完整的背根神经节（DRG）制备中，每个神经元均被一层薄薄的卫星胶质细胞包裹。
3. 利用电极施加正压，穿过卫星胶质细胞层，直至观察到神经元与周围卫星胶质细胞层之间出现突然扩大的空隙。继续将电极向神经元推进，直至在神经元表面观察到“凹陷”（dimple）现象。
   注意：与分离神经元的记录相比，此处需要稍大的正压，有助于穿透卫星胶质细胞层，提高成功形成膜片钳的概率。
4. 降低正压。随后通过轻柔抽吸形成吉欧姆（giga ohm）级密封。
   注意：采用此方法，记录成功率至少可达70%。
5. 按照先前描述的方法获得全细胞记录构型。
   1. 通过短暂但强烈的抽吸，穿透神经元细胞膜。或者，在施加抽吸的同时使用放大器的“zap”功能。
   2. 一旦建立全细胞模式，旋转放大器上的电容和电阻补偿旋钮，对全细胞电容和串联电阻（Rs）进行补偿。
      注意：Rs通常为5–20 MΩ。
   3. 若初始Rs大于30 MΩ，或在记录过程中变化超过20%，则放弃该细胞。同时测量静息膜电位；若静息膜电位高于-50 mV，则放弃该细胞。
6. 关闭“膜测试”窗口。旋转放大器上的模式旋钮，选择“I-clamp normal”模式。
7. 在软件中点击“打开方案”（open protocol），选择并加载用于测量阈值电流（rheobase）的实验方案。点击“记录”（record）开始采集数据。通过逐步注入100 pA递增的去极化电流，测量输入电阻和阈值电流，以评估神经元的兴奋性。
   1. 在软件中点击“打开方案”，选择并加载用于测量阈值电流的实验方案。点击“记录”开始采集数据。通过逐步注入100 pA递增的去极化电流，测量输入电阻和阈值电流，以评估神经元的兴奋性。
   2. 使用数据采集与分析软件（例如Clampfit），根据制造商说明书分析所记录的信号轨迹。软件基于超极化电流期间的稳态I-V关系计算输入电阻（Rin）。移动光标以测量阈值电流（rheobase）和膜电位阈值。注意：诱导动作电位（AP）所需的最小电流强度定义为阈值电流（rheobase），而诱导动作电位所需的最低电压定义为膜电位阈值。
8. 记录配体诱导电流。
   1. 用特定激动剂填充电极。
      注意：在本研究中，我们使用100 µM谷氨酸和100 µM AITC，分别诱导由谷氨酸受体和TRPA1受体介导的电流。
   2. 检查电极，确保内部无气泡。将电极放入电极夹持器中，并将夹持器通过管道连接至药物递送系统。
   3. 使用操纵器将电极移至距离神经元50 µm以内。设置药物递送系统的压力为1 psi，持续时间为1秒。切换记录模式至电压钳模式，并将膜电位钳制在-70 mV。短暂启动药物递送系统施加压力，记录药物诱导的电流。

表1

100 ml 细胞内溶液
浓度 (mM)	组分	MW	g
130	KGluconate	234.24
10	KCl	74.55
10	HEPES	238.3
10	EGTA
2	MgCl2*6H2O	203.3
注：用 KOH 调节 pH 至 7.4，并用蔗糖和蒸馏水调节渗透压至 260 - 280 mOsm。使用前加入 2 mM MgATP、0.5 mM Na2GTP，并过滤。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
玻璃移液管	Sutter	BF150-110-7.5
固定锚	Havard apparatus	64-0250	稳定背根神经节以避免漂移。
蠕动泵	WPI
移液管拉制仪	Sutter	P97
放大器	Molecular devices	Axopatch 200B
模数转换器	Molecular devices	1440D
显微镜	NIKON	FN600
微操纵器	Sutter	MPC200
碳酰气（95% O2, 5% CO2）	本地医用气体供应商