小鼠耳蜗特定频率区域带状突触的评估

摘要

来源：Yu, S., 等. 小鼠耳蜗特定频率区域带状突触的形态学与功能评估。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频展示了一种用于评估小鼠耳蜗特定区域带状突触的方法。该方法利用免疫染色和共聚焦成像技术，识别每圈耳蜗不同频率区域中的功能性突触。

方案

所有涉及动物操作的实验步骤均按照本机构的IRB指南进行。

1. 动物选择

1. 所有实验均使用成年雄性 C57BL/6J 小鼠（8 周龄）作为动物模型。
   注意：携带 Cdh23 剪接变异体的 C57BL/6J 小鼠在听觉系统中表现出加速衰老现象，表现为在 6 月龄时耳蜗基底回的带状突触损失 40%，中回损失 10%，随后随着年龄增长，整个耳蜗的突触损失迅速增加。因此，建议在听觉研究中谨慎使用超过 6 个月龄的 C57BL/6J 小鼠。根据具体实验目的，也可选用其他品系的小鼠。
2. 在进行听力评估前，使用专业诊断用便携式耳镜检查小鼠，以排除外耳或中耳病变。可能的体征包括外耳道内有液体或脓液、局部组织红肿以及鼓膜穿孔。
   注意：尽管此类情况较为罕见，但一旦发现患有外耳或中耳疾病的小鼠，应予以剔除。

2. 听力评估

1. 使用盐酸氯胺酮（100 mg/kg）和盐酸赛拉嗪（10 mg/kg）混合物进行腹腔注射以麻醉小鼠。通过疼痛刺激（例如脚趾夹捏反射）判断麻醉深度。
   注意：当脚趾夹捏反射完全消失时，表明动物已达到听觉测试所需的适当麻醉深度。若需要更长时间进行双侧ABR（听觉脑干反应）记录，可给予较低剂量（原始剂量的五分之一）的麻醉剂以维持原有麻醉水平。需注意避免麻醉过量，否则可能导致小鼠死亡。
2. 使用温控加热垫将麻醉后小鼠的体温维持在37.5 °C。将麻醉动物置于电学和声学屏蔽的房间内，以避免听力测试过程中受到干扰。
   注意：在整个实验过程中直至动物完全苏醒前，均应维持其生理体温，以防止因麻醉后低体温导致死亡。
3. 将皮下针电极（20 mm，28 G）分别插入颅顶（记录电极）、测量耳耳廓下方同侧腮腺区（参考电极）和对侧腮腺区（接地电极），插入深度均为皮下3 mm。
4. 使用封闭场扬声器通过一根2 cm长、锥形尖端的塑料管进行声刺激，并将管尖插入外耳道。
   注意：确保记录电极与参考电极的电学阻抗低于3 kOhm（通常为1 kOhm）。若阻抗过高，应更换电极插入位置，用酒精清洁电极或更换新电极，以避免ABR波幅发生改变。
5. 进行ABR记录时，生成短音信号（持续时间3 ms，上升/下降时间各1 ms，刺激速率21.1次/秒，频率范围：4–48 kHz），并以5–10 dB SPL为步长，从90 dB逐步递减至10 dB的声压级（SPL）进行呈现。在此过程中，信号被放大（10,000倍）、滤波（0.1–3 kHz）并平均（每刺激强度采集1,024次样本）。
   注意：ABR数据通常以10 dB为步长采集每个刺激强度的反应，在接近阈值时额外增加5 dB的步长。
6. 在每个频率下确定ABR阈值，即能够通过视觉识别出一个或多个可分辨波形的最小声压级（SPL），且该波形可被明确辨认。
   注意：通常需要在接近阈值的低声压级重复测试，以确认波形的一致性。反应阈值定义为仍能观察到波形的最低刺激强度，当刺激强度再降低5 dB时，波形即消失。

3. 耳蜗组织处理

1. 完成ABR记录后，通过颈椎脱位法处死麻醉的小鼠，断头后从腹侧暴露鼓室，用锋利的剪刀打开鼓室以进入耳蜗。
2. 使用精细镊子取出颞骨，切断镫骨动脉，从卵圆窗移除镫骨，并刺破圆窗膜。用针头（13 mm，27 G）轻轻旋转，在耳蜗顶处打一个小孔。
3. 将分离的骨骼在4%（wt/vol）多聚甲醛的0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）中于4 °C固定过夜。使用细尖移液器，通过卵圆窗或圆窗（作为入口）和顶孔（作为出口），将固定液轻柔地冲洗过迷路间隙。
   注意： 某些蛋白质需要较短的固定时间，以避免其抗原表位在免疫标记过程中被破坏。在此类情况下，根据免疫组织化学试剂制造商的说明，可在室温（RT）下将骨骼在4%多聚甲醛中孵育2小时。也可通过心脏灌注进行固定，以清除耳蜗血液，避免在后续阶段出现非特异性染色导致的背景噪声，尤其是在耳蜗突触病变的小鼠模型中。
4. 用0.1 M冷PBS清洗骨骼三次，每次5分钟，以去除残留的多聚甲醛。使用10%乙二胺四乙酸（EDTA）在室温下轻轻振荡4小时，或在4 °C下振荡24小时（水平摇床转速20 rpm）进行脱钙。EDTA溶液可在中途更换。
   注意： 脱钙时间取决于EDTA浓度及使用者偏好。脱钙后的组织应保持一定的韧性，以便于后续步骤中耳蜗整体封片的制备操作。颞骨可在10% EDTA中通过旋转脱钙，使研究人员在完成ABR测试和固定实验后可离开实验室。在4 °C条件下，脱钙时间可在20至30小时范围内灵活调整。
5. 将一块脱钙后的颞骨从EDTA转移至0.1 M PBS中。使用#3和#5 Dumont镊子以及27 G针头，在体视解剖显微镜下依次分离耳蜗的顶回、中回和基底回，并将耳蜗从骨骼中解剖出来。沿螺旋韧带使用刀片进行一系列小切口，移除盖膜和前庭膜（图1）。
   注意： 只要解剖出的耳蜗保持完整，此过程可根据操作者的常规方案进行适当调整。
6. 进一步将包括螺旋缘在内的剩余听觉上皮组织分离为独立的耳蜗回（顶回、中回和含钩区的基底回），用于整体封片制备。
7. 在光学显微镜40倍油镜下，使用置于目镜中的250 μm刻度尺测量基底膜长度，该刻度尺可沿内毛细胞静纤毛方向调整。
8. 通过累加各段长度（每段250 μm）计算每个耳蜗回的长度，同时通过累加各回长度获得基底膜的总长度。
9. 将包含钩区在内的基底膜总长度转换为相对于耳蜗顶点距离的百分比（0%表示耳蜗顶点，100%表示耳蜗基底）。
10. 利用对数函数（d(%) = 1 - 156.5 + 82.5 × log(f)，频率每倍频程斜率为1.25 mm，其中d为从耳蜗顶点起算的归一化距离百分比，f为频率，单位为kHz）将该距离转换为耳蜗特征频率，如前所述。由此可获得每个耳蜗回基底膜对应区域的频率范围。

4. 免疫荧光染色

1. 解剖后，将每个耳蜗转置于独立的 2.5 mL 离心管中，并在室温下于旋转仪上用含 10% 山羊血清、PBS 和 0.1% Triton X-100 的溶液孵育 1 小时。
2. 在解剖显微镜下，使用 200 μL 移液器吸头从各管中移除上述封闭/通透溶液，并将样本在含 5% 山羊血清、PBS 和 0.1% Triton X-100 的溶液中稀释的一抗中，于 4 °C 在旋转仪上避光孵育过夜。
   注意：对耳蜗突触带进行免疫标记时，使用突触前标记物小鼠抗羧基末端结合蛋白 2 IgG1（CtBP2，标记 RIBEYE 支架蛋白的 B 结构域，1:400）和突触后标记物小鼠抗谷氨酸受体 2 IgG2a（GluR2，标记 α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸（AMPA）受体的一个亚基，1:200）。
3. 用 0.1 M 冷 PBS 洗涤三次，每次 5 分钟，以去除残留的一抗，然后将样本在含 5% 山羊血清、PBS 和 0.1% Triton X-100 的溶液中稀释的二抗中，于室温避光条件下在旋转仪上孵育 2–3 小时。
   注意：使用山羊抗小鼠 Alexa Fluor 568（IgG1，1:500）和山羊抗小鼠 Alexa Fluor 488（IgG2a，1:500）配制合适的二抗混合液，这些二抗与步骤 4.2 中使用的一抗相匹配。为提高突触带标记效率，建议选择特异性二抗。部分实验室会延长二抗孵育时间以增强 GluR2 免疫标记。
4. 用 0.1 M PBS 洗涤三次，每次 5 分钟，以去除残留的二抗，并将样本从 2.5 mL 离心管转移至含有 0.1 M PBS 的 35 mm 培养皿中。
5. 在载玻片上滴加含 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂，将样本从 PBS 中转移至封片剂中。将盖玻片的一边接触载玻片，然后缓慢释放，使其自然落下。
   注意：为确保毛细胞朝上，且在操作过程中耳蜗样本不发生折叠或扭曲，应在体视解剖显微镜下进行耳蜗样本的封片。
6. 将载玻片置于载片盒中，于 4 °C 静置过夜，使样本干燥，随后在激光共聚焦显微镜下成像。

5. 耳蜗带状突触的形态学评估

1. 使用共聚焦显微镜配合三种激光器进行切片成像：405 nm 紫外二极管激光器、488 nm 氩离子激光器和 561 nm 二极管泵浦固态（DPSS）激光器，分别用于激发 DAPI（激发光谱 409–464 nm）、Alexa Fluor 488（激发光谱 496–549 nm）和 Alexa Fluor 568（激发光谱 573–631 nm）。
2. 使用 63 倍高分辨率油浸物镜，对每个耳蜗转角区域采集跨度为 8 μm 的共聚焦 z 轴层扫图像。
   ​注意：一旦确定，所有用于数字化显微图像的参数应予以保存，并统一应用于所有切片。
3. 对于突触斑点计数，设置 z 轴层扫（步长 0.3 μm）以覆盖内毛细胞（IHCs）的整个长度，从而确保所有突触斑点均可被成像。
4. 将包含斑点的 z 轴层扫图像合并，获得 z 轴投影，并导入图像处理软件。
5. 将特定频率区域每个 z 轴层扫中的突触总数除以 IHC 数量（等于 DAPI 核染色的手动计数），以计算每个 IHC 的突触斑点数量。在每个特定频率区域，对三个不同显微视野图像（每个含 9–11 个 IHC）中的突触斑点数量取平均值。
   1. 使用手绘选择工具，勾画包含每个 IHC 基底外侧区域的感兴趣区域（ROIs）。利用测量功能自动量化斑点数量，并使用分水岭功能区分紧密相邻的斑点。
   2. 每次自动计数后，需进行视觉检查并手动校正，以确保突触斑点计数的可靠性。
      注意：实验操作者应保持盲态，即不清楚切片来源于耳蜗的顶转、中转还是底转。
6. 通过铅笔工具（M）手动将单个 IHC 从其邻近细胞中分离，以直观评估突触结构与分布，从而更清晰地观察细胞骨架结构和突触定位。
7. 为观察突触前带状体（CtBP2）与突触后受体斑块（GluR2）的相对位置关系，使用矩形选区工具提取围绕带状体的体素空间，并通过裁剪功能分离单个带状体。点击 图像 > 图像大小，生成这些微型投影的缩略图阵列，可用于识别成对突触（表现为 CtBP2 阳性和 GluR2 阳性斑点紧密相邻）与孤立带状体（缺乏突触后谷氨酸受体斑块）（图 2）。
   注意：正常耳蜗突触表现为毛细胞内的突触前带状体（抗 CtBP2 抗体标记）与听觉神经末梢上的突触后谷氨酸受体斑块（抗 GluR2 抗体标记）共定位。部分实验室结合共聚焦投影与三维建模技术，用于量化突触斑块的大小或体积。在 ribbon 突触显著丢失之前，带状体大小改变或缺乏配对的谷氨酸受体斑块，可能提示突触功能障碍。

结果

图1：小鼠耳蜗的频率定位 。 （A）在体视解剖显微镜下从颞骨中完整分离出的耳蜗的代表性图像。（B）小鼠耳蜗分为顶回、中回和底回，图中已去除耳蜗外侧壁。基底膜片段上的红色圆圈表示不同频率的位置及其在耳蜗中的标准化位置（0% 指耳蜗顶，100% 指耳蜗底）。比例尺 = 250 μm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
盐酸氯胺酮	福建古田药业有限公司，中国福建	H35020148	100 mg/kg
盐酸赛拉嗪	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	X-1251	10 mg/kg
TDT生理记录装置	Tucker-Davis Technologies，美国佛罗里达州阿拉楚阿	Auditory Physiology System III
SigGen/BioSig软件	Tucker-Davis Technologies，美国佛罗里达州阿拉楚阿	Auditory Physiology System III
电热垫	Pet Fun	11072931136
Dumont 3#镊子	Fine Science Tools，加拿大不列颠哥伦比亚省北温哥华	0203-3-PO
Dumont 5#镊子	Fine Science Tools，加拿大不列颠哥伦比亚省北温哥华	0209-5-PO
体视解剖显微镜	尼康公司，日本东京	SMZ1270
山羊血清	中杉金桥生物技术有限公司，中国北京	ZLI-9021
抗谷氨酸受体2（细胞外区），克隆6C4	Millipore公司，美国马萨诸塞州比勒里卡	MAB397	小鼠
纯化小鼠抗CtBP2抗体	BD Biosciences，美国马萨诸塞州比勒里卡	612044	小鼠
Alexa Fluor 568 山羊抗小鼠IgG1抗体	赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	A21124	山羊
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠IgG2a抗体	赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	A21131	山羊
含DAPI的封片剂	中杉金桥生物技术有限公司，中国北京	ZLI-9557
共聚焦荧光显微镜	徕卡显微系统公司，德国韦茨拉尔	TCS SP8 II
Image Pro Plus软件	Media Cybernetics，美国马里兰州贝塞斯达	版本6.0
专业诊断用便携式耳镜	上海路德医疗仪器贸易有限公司，中国上海	HS-OT10
针电极	西安友谊医学电子有限公司，中国西安	1029	20 mm, 28 G
密闭场扬声器	Tucker-Davis Technologies，美国佛罗里达州阿拉楚阿	CF1