评估共培养体系中谷氨酸能神经元与胶质瘤细胞的相互作用

摘要

来源：Fuchs, Q. 等.，将谷氨酸能神经元与儿童高级别胶质瘤细胞共培养于微流控装置中以评估电相互作用。J. Vis. Exp. (2021)

本视频展示了利用带有微电极阵列的微流控装置，在由人诱导多能干细胞衍生的皮层谷氨酸能神经元与胶质瘤细胞共培养体系中，评估神经元电活动的方法。

方案

所有涉及样本采集的步骤均按照本机构的IRB指南进行。 

1. 共培养方案

1. 调整UW479和BT35细胞系的接种时间和浓度，以确保在共培养开始时细胞汇合度达到80%，这对应于谷氨酸能神经元培养的第21天。
2. 用胰酶消化UW479和BT35细胞，并将其接种至各专用微流控装置中已成熟的谷氨酸能神经元上层（每种细胞类型的靶密度为900个细胞/mm²），随后将儿童高级别胶质瘤（pHGG）细胞接种至含有成熟谷氨酸能神经元的微流控装置中。
3. 在受控环境（37 °C，5% CO₂）下，使用自谷氨酸能神经元第11天起的培养基（详见表1）继续维持共培养体系2天。
4. 利用图像分析软件分析显微图像，对pHGG细胞进行计数以评估其存活率，并计算细胞百分比。
   ​注意：使用以下公式计算：100 - （（D23细胞数 / D21细胞数）× 100）。

2. 电生理记录

1. 使用商业系统和市售软件进行电生理记录。
   注意： 实验采用多电极阵列（MEA）进行，该阵列由直径为 30 µm、间距为 100 µm 的电极组成。
2. 在接种 pHGG 细胞前的第 21 天（D21）对谷氨酸能神经元进行首次电生理记录。将已分化的谷氨酸能神经元作为对照组，并与共培养组平行单独培养。按照下一步（步骤 3）所述方法，对两种条件均进行第二次记录。
3. 在第 23 天（共培养 2 天后）进行第二次电生理记录。

表1：由人诱导多能干细胞衍生的谷氨酸能神经元的培养基成分。

组分	接种培养基	D4 培养基	D7 培养基	D11 及以后培养基
DMEM/F-12 培养基	0.5x	0.25x	0.125x	Ø
Neurobasal 培养基	0.5x	0.25x	0.125x	Ø
BrainPhys 培养基	Ø	0.5x	0.75x	1x
SM1 补充剂	1x	1x	1x	1x
N2 Supplement-A	1x	1x	1x	1x
Ala-Gln (GlutaMax)	0.5 mM	0.5 mM	0.5 mM	0.5 mM
BDNF	10 ng/mL	10 ng/mL	10 ng/mL	10 ng/mL
GDNF	10 ng/mL	10 ng/mL	10 ng/mL	10 ng/mL
TGF-β1	1 ng/mL	1 ng/mL	1 ng/mL	1 ng/mL
Geltrex	30 µg/mL	Ø	Ø	Ø
Seeding Supplement	1x	Ø	Ø	Ø
Day 4 Supplement	Ø	1x	Ø	Ø

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
256MEA100/30iR-ITO-w/o	MCS	256MEA100/30iR-ITO-w/o
用于 Scepter 计数器的 40 µm 探针	Dutscher	53750
用于 Scepter 计数器的 60 µm 探针	Dutscher	51999
Ala-Gln（GlutaMAX）	Sigma	G8541
II 级生物安全柜	Thermo Scientific	HERASafe 型号 KS12
皮层谷氨酸能神经元	BrainXell	BX-0300
DMEM/F12 培养基	Sigma	D8437
DPBS 1X	Dutscher	L0615-500
EasYFlaskTM 细胞培养瓶 75 cm³	Nunc	156499
胎牛血清（FBS）	Dutscher	500105
GDNF	Peprotech	450-10
Geltrex	Life Technologies	A1413201
人 BDNF	Peprotech	450-02
培养箱	Memmert	IC0150med
MEA2100	MCS	181205-MEA2100-11240
微量移液器 P10	Sartorius	LH-729020
微量移液器 P100	Sartorius	LH-729050
微量移液器 P1000	Sartorius	LH-729070
微量移液器 P200	Sartorius	LH-729060
Eppendorf 1.5 ml 安全锁微量离心管	Dutscher	33290
多通道实验系统	MCS	-
N2 补充剂-A	StemCell	7152
Neurobasal 培养基	Life Technologies	21103049
Neurocult SM1 神经元补充剂	StemCell	5711
不含 L-谷氨酰胺的非必需氨基酸（NEAA）	Dutscher	X0557-100
Pipeteur Pipet-Aid XP 重力式移液控制器	Drummond	4000202/4038202
细胞培养用移液管 10 mL Falcon®	Dutscher	357551
细胞培养用移液管 5 mL Falcon®	Dutscher	357543
加热板（CultureTemp）	Belart	370151000
多聚-D-赖氨酸	Sigma	P6407
Primovert 显微镜	Zeiss	415510-1100-000