将电极阵列和光纤植入小鼠海马体

摘要

来源：Bender, F., 等，行为小鼠中海马θ振荡的光遗传学同步。 J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了在小鼠模型的海马体中进行立体定位植入金属丝电极阵列和光学纤维的操作过程。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 视觉纤维的制备（图1A）

1. 使用多模光纤（105 µm 纤芯，石英纤芯玻璃包层，0.22 数值孔径）。当光纤仍连接在光纤盘上时，使用微剥钳剥离光纤纤芯的 125 µm 包层。
2. 使用金刚石刀将光纤切割至约 2–3 cm 长度。
3. 将光纤插入氧化锆陶瓷插针套管中（内径：126 µm）。光纤应从套管的凸面端突出约 0.5–1 mm。
4. 使用针头在套管两端各滴一滴环氧胶，但不要将胶涂在套管侧面。也可使用氰基丙烯酸酯胶（快干胶）替代。
5. 让胶水至少干燥 30 分钟。
6. 使用金刚石研磨膜（3 µm 粒径）抛光套管的凸面端。
7. 使用光功率计检测光传输的保真度。
   1. 将光功率计的波长设置为与所用激光器相同的波长。
   2. 将跳线光纤的端面朝向传感器中心放置。开启激光器，读取光功率计的光输出值，并记录该数值。
   3. 通过对接套筒将光学纤维与跳线光纤连接，并将光纤端面朝向传感器中心放置。开启激光器，读取光功率计的光输出值，并记录该数值。
   4. 通过将第二个数值除以第一个数值计算传输率。若传输率低于 0.5，则弃用该光纤；否则可用于植入。
   5. 在植入前对每根光纤测试其传输率。
   6. 对于后续实验，根据光纤的传输率调整激光器的光强输出：将跳线光纤端面的光输出设定为 5–15 除以传输率，以确保光纤端面的最终光输出为 5–15 mW。

2. LFP记录用钨丝电极阵列的制备（图1B）

1. 将若干根（例如6根）100 µm石英管导管平行粘贴在一段胶带的粘性面。每根导线阵列组件裁取约4-6 mm长的一段。
2. 使用镊子将涂有聚乙烯醇缩醛绝缘层的45 µm钨丝穿入导管中。
3. 使用手术刀刮除六根漆包细铜键合导线（长约5 mm）和一根接地导线（长约2-3 cm）两端的绝缘层，露出金属。将它们焊接到纳米连接器的引脚上。
4. 分别用一滴银导电漆将每根键合导线连接至一根钨丝。静置干燥至少30分钟。
5. 使用最少剂量的牙科水泥覆盖导线。避免将水泥涂在将插入脑组织的钨丝部分或纳米连接器的上部。让水泥干燥至少30分钟。
6. 使用钝口不锈钢剪刀对钨丝进行斜切（5-20°），以便可靠地将导线植入锥体细胞层腹侧邻近区域的上方或下方，该区域θ波振幅过低，无法准确评估同步化保真度。
7. 使用手术刀刮除接地导线末端（约2 mm）的绝缘层，露出金属。用助焊剂处理并预先上锡。
8. 使用数字万用表检查电极之间的潜在串扰。将连接器引脚与设置为电阻测量模式的万用表连接，逐对检测各通道组合；若万用表读数低于5 MΩ，则表明存在显著串扰。
9. 使用阻抗仪检测每根导线电极在生理盐水中的阻抗。典型阻抗值应低于100 kΩ。
10. 为便于植入，将一根光纤粘附在导线阵列上，使光纤末端与最短导线处于同一水平位置，且光纤末端紧邻但不接触钨丝。应尽可能减小光纤角度，以防止植入过程中对组织造成损伤。

3. 立体定位移植

1. 去除颅骨顶部的结缔组织，并将颈部肌肉充分下压约 2 mm，以防止记录过程中出现肌肉伪迹。
2. 使用棉签和生理盐水清洁颅骨，并钻四个孔（前部两个，小脑上方两个，直径 0.8 mm），用于植入不锈钢骨螺钉（00-96x1/16），作为接地和固定装置（图 1D）。将连接一根铜线（长约 2–3 cm）的接地螺钉置于小脑上方。
3. 用牙科水泥完全覆盖接地螺钉，以防止电生理记录期间产生肌肉伪迹。用牙科水泥构建连接所有螺钉的环形结构（图 1E）。
4. 在植入侧（海马，以前囟为参考点，AP -1.94，L 1.4，V 1.4）进行颅骨开窗。在脑组织表面滴加约 5 µL 无菌 NaCl 溶液。
5. 使用立体定位仪缓慢将线阵列 lowered 至颅骨开窗处。若进行单细胞记录，则用硅胶探针替代线阵列。为避免光电信号伪迹，应将光纤单独植入海马，且光纤尖端不直接朝向探针（图 1C—I）。若需研究双半球间节律同步的协调性，则在对侧海马 CA1 区额外植入一根光纤。
6. 为保护脑组织，使用注射器在植入部位上方滴加约 5 µL 预热至 70 °C 的温热液态石蜡/石蜡油。
7. 在线阵列周围涂抹牙科水泥，并用牙科水泥覆盖整个颅骨表面。
8. 使用例如针头，在预先焊好的接地/参考导线以及连接至接地螺钉的预焊导线上各加一滴助焊剂，然后使用焊锡机将导线熔接。
9. 用牙科水泥完全覆盖整个接地导线。
10. 术后立即腹腔注射 0.3 mL Erycinum（用无菌 NaCl 按 1:4 稀释）和卡洛芬（carprofen，5 mg/mL），并在术后至少连续两天继续给药。小鼠通常在术后 15 分钟内苏醒。使用红光灯加热动物以加快恢复。
11. 术后第一周内每日监测小鼠体重，直至体重稳定。体重下降不应超过术前记录体重的 10%。为加速体重恢复稳定，术后最初几天应为小鼠提供湿粮和炼乳。
12. 为记录节律同步期间海马的细胞活动，将硅胶探针植入海马（AP -1.94，L 1.4，V 1，后续可进一步下调）（图 1C—I）。将光纤植入海马（AP -3，L 1.4，V 1.6，头尾方向倾斜 39°）。若需刺激细胞胞体，可在隔核（MS）额外植入一根光纤（AP +0.98，L 1，V 3.9，侧向倾斜 15°）。

结果

图 1：光纤、电极及手术示意图。 （A）光纤示意图。（B）将记录电极阵列粘附于光纤上，用于在海马θ节律夹带过程中记录海马局部场电位（LFP）的示意图。（C）为记录海马细胞活动，将硅探针安装于微型驱动装置上。（D）微型螺钉固定于颅骨上；铜导线在置于小脑上方前，已预先焊接到接地螺钉和参考螺钉上。（E）使用牙科水泥覆盖并连接各螺钉。上方蓝色圆圈表示为植入硅探针而实施开颅的位置；下方蓝色圆圈表示为在海马植入光纤而实施开颅的位置。（F）将一根光纤以尾侧...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PV-Cre 小鼠	杰克逊实验室	B6;129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J
立体定位仪	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	Model 963	超精密小型动物立体定位装置
钻头，0.8 mm	Bijoutil, Allschwil, 瑞士	49080HM
焊接站	Weller Tools GmbH, Besigheim, 德国	WSD 81
红霉素	Rotexmedica GmbH, Trittau, 德国	PZN: 10823932	1g 注射用溶液粉末
精密钻磨机	Proxxon, Wecker, 卢森堡	fbs 240/e
多模光纤	ThorLabs, Dachau, 德国	FG105LCA	0.22 数值孔径，低羟基，核心直径 Ø105 µm，波长范围 400 - 2400 nm
陶瓷插针套管	Precision Fiber Products, Milpitas, CA, USA	CFLC126	陶瓷 LC 多模套管，内径 126 µm
抛光纸	Thorlabs	LF3D	6" x 6" 金刚石研磨（抛光）片
功率计	Thorlabs	PM100D	紧凑型功率和能量计主机，数字式 4" LCD 显示屏
多模光纤耦合器	Thorlabs	FCMM50-50A-FC	1×2 多模耦合器，50:50 分光比，50 µm 渐变折射率光纤，FC/PC 接口
光纤跳线	Thorlabs	FG105LCA CUSTOM-MUC	定制，3 m 长，带保护套管，套管型号：FT030，连接器 1：FC/PC，连接器 2：1.25 mm (LC) 陶瓷插针
套筒	Precision Fiber Products, Milpitas, CA, USA	ADAL1	用于 Ø1.25 mm (LC/PC) 插针的陶瓷分体式对接套筒
钨丝	California Fine Wire Company, Grover Beach, CA, USA	CFW0010954	40 µm，纯度 99.95%
毛细管	Optronics	1068150020	内径：100.4 µm
Omnetics 纳米连接器	Omnetics Connector Corporation, Minneapolis, USA	A79038-001
螺丝	Bilaney, 杜塞尔多夫, 德国	00-96x1/16	不锈钢
导电银漆	Conrad electronics, 德国	530042
液体助焊剂	Felder GMBH Löttechnik, Oberhausen, 德国	Lötöl ST	DIN EN 29454.1, 3.2.2.A (F-SW 11)