光遗传学调控海马网络动态

摘要

来源：Manseau, F.，等。体外海马θ节律的调控：分离啮齿类动物隔-海马环路记录技术。J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了利用光遗传学方法，通过激活小鼠脑切片中经基因改造的光敏感性中间神经元，调控海马网络动态，增强θ振荡同步性，并研究神经环路行为的技术流程。

方案

所有涉及动物样本的操作均已被相应的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 离体海马中的光遗传学控制
   注意： 为实现对海马网络活动的光遗传学控制，本研究采用一种细胞类型特异性策略，即节律性激活含PV（小清蛋白阳性）的GABA能细胞，因为已有研究表明这些细胞在离体海马中对主细胞群体的同步化起着关键作用。通过将PV-Cre小鼠品系与组成型Cre依赖性表达兴奋性通道视紫红质-2（ChR2）的小鼠（Ai32）杂交，可在PV细胞中特异性表达ChR2，从而获得PV-ChY小鼠。 alternatively，可使用病毒载体构建体（例如，AAVdj-ChETA-eYFP）可注射至PV-Cre或PV-TOM小鼠（P15-16）的海马体，以驱动CA1/SUB中间神经元中兴奋性视蛋白的表达（图1A).
   1. 在表达蓝光敏感性兴奋性视蛋白ChR2的PV中间神经元小鼠的离体海马中，将LFP电极置于CA1/SUB（Cornu ammonis-1/下托）区域，并对附近的一个锥体细胞进行膜片钳记录。
   2. 将一根直径为0.2–1 mm的光纤导光束置于海马组织制备区上方，并使其对准记录区域。使用LED光源发出的蓝光（473 nm）进行光遗传学刺激，刺激方式包括由晶体管-晶体管逻辑信号触发的光脉冲（10–20 ms）或以θ频率（4–12 Hz）递送的正弦波电压指令。
   3. 切换到电流钳模式，并表征锥体细胞在自发θ振荡期间的活动特性。
   4. 启动刺激程序并记录光反应。观察到在光遗传学刺激过程中，所记录神经元的场振荡和突触活动逐渐趋于同步，且对PV细胞进行节律性驱动可有效调控theta振荡的频率和功率。图1).

结果

图1：离体海马中自发性及光遗传驱动的θ振荡期间，单个CA1/SUB锥体神经元和PV神经元的局部场电位与同步膜片钳记录。

（a）示意图显示记录LFP和膜片电极的位置，以及光导纤维置于表达蓝光敏感视蛋白（ChETA与荧光蛋白eYFP偶联）的CA1/SUB区域上方。（b）记录到的锥体神经元的表征，显示典型的规则性放电（RS）特性（上图），以及该细胞的高倍放大（40X）图像（下图）。（c）同一细胞在去极化膜电位下的电流钳记录样本（黑色），同时显示局部场电位信号（灰色）...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
氯化钠	Sigma Aldrich	S9625
蔗糖	Sigma Aldrich	S9378
碳酸氢钠	Sigma Aldrich	S5761
磷酸二氢钠（一碱磷酸钠）	Sigma Aldrich	S8282
硫酸镁	Sigma Aldrich	M7506
氯化钾	Sigma Aldrich	P3911
D-(+)-葡萄糖	Sigma Aldrich	G7528
二水合氯化钙	Sigma Aldrich	C5080
抗坏血酸钠	Sigma Aldrich	A7631-25G
设备
95% O₂/5% CO₂ 气体混合物（碳酰气）	Vitalaire	SG466204A	灌流系统
玻璃瓶/烧瓶（4 × 1 L）	n.a.	n.a.	灌流系统
浸没式记录室	定制设计（FM）	n.a.	可使用商用替代品
Multiclamp 700B 膜片钳放大器	Molecular devices	MULTICLAMP	电生理学
Multiclamp 700B Commander 程序	Molecular devices	MULTICLAMP	电生理学
数模转换器	Molecular devices	DDI440	电生理学
显微操作器（手动）	Siskiyou	MX130	电生理学（LFP）
显微操作器（自动）	Siskiyou	MC1000e	电生理学（膜片钳）
音频监测器	A-M Systems	Model 3300	电生理学
定制直立荧光显微镜	Siskiyou	n.a.	成像
模拟视频摄像机	COHU	4912-2000/0000	成像
带成像软件的数字图像采集卡	EPIX, Inc	PIXCI-SV7	成像
Olympus 2.5倍物镜	Olympus	MPLFLN	成像
Olympus 40倍水浸物镜	Olympus	UIS2 LUMPLFLN	成像
定制发光二极管（LED）系统	定制	n.a.	光遗传学刺激（Amhilon 等，2015）
动物
PV::Cre (KI) 小鼠	Jackson Laboratory	品系编号 008069	允许在PV中间神经元中进行Cre介导的基因表达
组成型-条件型 Ai9 小鼠（R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI)）	Jackson Laboratory	品系编号 007905	在Cre介导的重组后表达TdTomato
Ai32 小鼠（R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP）	Jackson Laboratory	品系编号 012569	在Cre重组酶作用后表达改良型通道视紫红质-2/EYFP融合蛋白
PVChY 小鼠	本单位繁育	n.a.	通过将PV-Cre品系与Ai32小鼠（R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP）杂交获得的后代