通过同步光刺激和视频录制评估功能性神经肌肉接头

所有涉及样本采集的程序均已按照研究所的 IRB 指南执行。

1. 生物反应器制备

1. 制作生物反应器模具
   1. 从补充 CAD 文件下载生物反应器 CAD（计算机辅助设计）文件或创建自定义设计。
   2. 使用 CAM（计算机辅助制造）软件从 3D 模型生成 CNC（计算机数控）刀具路径。
   3. 使用 CNC 铣床加工乙缩醛模具。
2. 生物反应器的制造
   1. 将聚二甲基硅氧烷（PDMS，每 4 个平台/模具 77 克混合物）的 10:1 碱与固化剂混合物混合。
   2. 将混合物放入真空室中，关闭所有阀门，打开真空，然后对混合物进行脱气至少 30 分钟，直到没有气泡残留。将混合物倒入模具中，并在真空室中对模具脱气 1 小时。
   3. 关闭模具，使模具的上半部分处于正确的方向。将一根钢制六角杆放在中心上，并夹紧两侧。
   4. 用 PDMS 重新填充顶部。
   5. 将模具在 65 °C 的烘箱中固化至少 4 小时。
   6. 冷却至室温后，从模具中取出平台。
   7. 使用洗洁精、400 mL 100% 异丙醇和蒸馏水在超声波浴中清洁设备 1 小时循环。
   8. 在 65 °C 下干燥过夜。
   9. 将玻璃盖玻片浸泡在 1% 非离子表面活性剂多元醇中 30 分钟，确保它们不会堆叠，以便它们都得到适当的涂层。
   10. 用蒸馏水冲洗干净，并在 65 °C 下干燥过夜。
   11. 用等离子清洗剂用 6 L/min 氧气高速处理玻璃盖玻片和 PDMS 平台 1-2 分钟。处理后，通过将 PDMS 向下压在盖玻片上至少 30 秒，将两者粘合在一起。
   12. 在添加单元之前对粘合的设备进行高压灭菌。

2. 构建光刺激装置

1. 使用 30 mm 笼式立方体系统，在中心连接一个 573 nm 二向色镜。将红色 627 nm LED（发光二极管）与 594 nm 长通激发滤光片耦合，并将其连接到立方体的顶部，使 LED 面向镜子。然后将带有 546 nm 短通激发滤光片的蓝色 488 nm LED 连接到立方体的相邻一侧，使 LED 面向镜子，如图 1A 中的示意图所示。
2. 将环形光圈光阑连接到笼式立方体的底部，以控制照明区域的大小。
3. 使用 T-Cube LED 驱动器为每个 LED 供电，并通过 Arduino Uno Rev3 板进行控制。将 LED 驱动器的侧面输入连接到电源插头，将中间输出连接到 Arduino，并将侧面输出直接连接到 LED。
4. 使用 USB 数据线将 Arduino Uno 连接到计算机。
5. 从 GitHub 链接 （https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis） 下载文件。
6. 从 GitHub 文件夹中打开 "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" 文件。
7. 设置起始参数: Steps = 30; startFrequency = 0.5; endFrequency = 3; pulseLength = 100。
8. 确保将引脚输出 4 分配给蓝色 LED 驱动器，将引脚输出 2 分配给红色 LED 驱动器。检查 LED 驱动器的中间线是否接地并连接到相应的引脚输出。
9. 编译 "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" 程序并将其加载到 Arduino 中。
10. 将每个 LED 驱动器连接到其相应的通道。

3. 细胞培养设置（第 -21-0 天）

1. 原代骨骼肌细胞
   1. 使用 Myotonic 生长培养基（+补充剂）解冻和扩增原代骨骼成肌细胞（从 Cook Myosite 获得）最多六代。将细胞维持在设置为 37 °C 和 5% CO₂ 的培养箱中。
   2. 每 2 天更换一次媒体。
   3. 一旦细胞达到约 60% 汇合，使用 0.05% 胰蛋白酶-EDTA（1x，在 37 °C 下 5 分钟）通过它们。收集解离的细胞并添加新鲜培养基以中和胰蛋白酶。
   4. 以 300 x g 的速度离心细胞，并吸出细胞沉淀上方的上清液。
   5. 用 MGM 重悬细胞，并以 1:3 的比例接种每个三层培养瓶 60 mL。
2. ChR2-hiPSC
   注意:用于这项工作的所有细胞系均按照美国纽约哥伦比亚大学的机构指南创建和使用。在该方案中，表达 ChR2 的 hiPSC 是使用先前描述的方法通过 CRISPR-Cas9 基因组编辑产生的18，但任何稳定的光遗传细胞系（慢病毒、piggyBac 等）都可以以相同的方式使用。选择在 iPSC 和 Motoneurons 中表达的组成型启动子 （CAG）。正如以前的出版物中所指出的，发现这些细胞具有健康的核型。
   1. 用 1 mL/孔在 DMEM/F12 （1:80） 中稀释的溶解基底膜基质涂覆 6 孔板，并在室温下孵育板 1 小时。
   2. 将 iPSC 接种在包被的 6 孔板上，加入 2 mL 无饲养层细胞培养基（iPSC 培养基），每隔一天更换 2 mL 培养基，每 5-7 天传代一次。将细胞保存在设置为 37°C 和 5% CO₂ 的培养箱中。
   3. 传代
      1. 通过将干细胞与 1 mL 无酶干细胞释放试剂孵育 4 分钟，并用宽头 P1000 移液器机械剪切干细胞来解离干细胞。
      2. 在 iPSC 培养基中以 1:24 或 1:48 的比例接种细胞，其中含 2 μM Y-27632 二盐酸盐，分 2 mL/孔，接种到包被的 6 孔板上。

4. 骨骼肌组织接种（第 -3 天）

1. 使用自动细胞计数仪分离和计数 30 x 106 个成肌细胞。
将
2. 成肌细胞重悬于 3 mg/mL 胶原蛋白 I 和溶解的基底膜基质（800 μL 胶原蛋白混合物 + 200 μL 基底膜基质，最终体积为 1 mL）的 4:1 混合物中。对于胶原蛋白成分，添加随附的中和剂（胶原蛋白与中和剂的 9:1 混合物）并用 1x PBS 稀释混合物以达到 800 μL 的体积。
3. 向生物反应器的每个肌肉室中加入 15 μL 细胞胶原悬浮液，确保使用移液器吸头将悬浮液涂抹在两个支柱上（图 2）。
4. 让细胞-凝胶混合物在 37 °C 下聚合 30 分钟，然后用 450 μL Myotonic 生长培养基填充每个生物反应器孔。
5. 3 天后（一旦凝胶压实），开始肌管分化。

5. 肌管分化（第 0-14 天）

1. 通过将组织切换到 450 μL 融合诱导培养基（FS，表 1）7 天开始肌管输注，每隔一天更换一次><培养基。 注意: 尝试在运动神经元从 hiPSC 分化的同一天开始肌管分化，以便在两种细胞类型的分化计划结束时播种运动神经元。
2. 第 7 天，将培养基更换为 450 μL 成熟培养基 Ia（MMIa，表 1）。
3. 第 9 天，改用 450 μL 成熟培养基 Ib（MMIb，表 1）。
4. 第 11 天，将培养基更换为 450 μL NbActiv4。每 2 天更换一次培养基，直到接种运动神经元（步骤 7）。

6. 运动神经元分化（第 0-14 天）

1. 在第 0 天，将 4 x 10⁶ 个 ChR2-hiPSC 转移到装有 15 mL 运动神经元悬浮培养基的超低附着培养皿中（MSCM，表 1）。用 3 μM CHIR99021、0.2 μM LDN193189、40 μM SB431542 水合物和 5 μM Y-27632 二盐酸盐补充 MSCM。
2. 第 2 天，用 37 μM 可逆过滤器分离神经球 （NS），并重新接种 15 mL 含有 3 μM CHIR99021、0.2 μM LDN193189、40 μM SB431542水合物和 0.1 μM 视黄酸的 MSCM。第 2 天后，NS 应在培养皿中可见，无需使用显微镜。
3. 第 4 天，将细胞和培养基转移到 50 mL 试管中，让神经球沉降到底部（5 分钟）。吸出上清液，将细胞重悬于 15 mL 补充有 0.5 μM SAG、0.2 μM LDN193189、40 μM SB431541 和 0.1 μM 视黄酸的 MSCM 中。
4. 第 7 天，重复步骤 6.3。但将细胞重悬于 15 mL 补充有 0.5 μM SAG 和 0.1 μM 视黄酸的 MSCM 中。
5. 第 9 天，重复步骤 6.3。但将细胞重悬于 15 mL 补充有 10 μM DAPT 的 MSCM 中。
6. 在第 11 天，重复步骤 6.3。但将细胞重悬于 15 mL 补充有 20 ng/mL BDNF 和 10 ng/mL GDNF 的 MSCM 中。
7. 第 14 天，将运动神经元播种到平台中。

7. 在生物反应器中接种运动神经元聚集体（第 14 天）

1. 制备 2 mg/mL 胶原蛋白 I 和基质胶的 4:1 凝胶混合物（800 μL 胶原蛋白混合物 + 200 μL 基质胶，最终体积为 1 mL）。对于胶原蛋白成分，添加随附的中和剂（胶原蛋白与中和剂的 9:1 混合物）并用 1x PBS 稀释混合物以达到 800 μL 的最终体积。
2. 使用 400 nm 细胞过滤器选择大的神经球并将它们重悬于凝胶混合物中。
3. 从储液器中吸出培养基，并小心地从神经球孔中吸出培养基（图 2）。
4. 将 15 μL 凝胶混合物添加到神经球通道中。
5. 在 10 μL 移液器中加入 10 μL 凝胶，然后选择一个神经球。
6. 将 NS 存入神经球通道并确保 NS 在腔室中。一旦 NS 沉积，慢慢抬起移液器，同时释放剩余的凝胶。如果不确定 NS 是否正确沉积，请使用显微镜检查其位置。
7. 让凝胶在 37 °C 下聚合 30 分钟。
8. 向储液槽中加入 450 μL NbActiv4，补充有 20 ng/mL BDNF 和 10 ng/mL GDNF。
9. 每隔一天更换一次培养基，以允许轴突从 NS 生长到肌肉组织。

8. 同时进行 NMJ 功能的光刺激和视频录制（第 24 天+）

1. 对于成像，使用带有科学互补金属氧化物半导体 （sCMOS） 相机的倒置荧光显微镜。
2. 将相机软件像素合并设置为2x2，曝光为20毫秒，滚动快门开启，读出率为540 MHz，动态范围:12位和增益1，传感器模式:重叠。
3. 在显微镜上使用 2 倍物镜对微组织进行成像。
4. 将活细胞室（37°C，5% CO_{2 ）}连接到显微镜载物台上。
5. 选择包含神经支配骨骼组织组织的感兴趣区域 （ROI），以最小化文件大小和处理时间。
6. 在样品和成像物镜之间放置一个 594 nm 长通发射滤光片，以过滤掉来自相机的蓝光脉冲。
7. 将包含 4 个生物反应器（24 个组织）的矩形 4 孔板放入活细胞室中。
8. 单击 Live View（实时视图）。以所需的 ROI 居中和聚焦图像。
9. 从 GitHub 文件夹 （https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis） 上传自定义宏代码，以控制舞台位置、Arduino 板和视频采集。
10. 将 Output movie （输出影片） 设置为 day_tissue group_tissue name_experiment.nd2。
11. 在舞台上设置所需的 X，Y 坐标运行宏代码，并以 50 帧/秒的速度获取 1700 帧的快速延时摄影。
12. 成像后更换培养基并将样品放回培养箱。在图像采集会话之间至少留出 24 小时以避免组织疲劳。

图 1.NMJ 功能的刺激、记录和分析。（A） LED 设置和光路示意图。（B） 使用倒置显微镜、活细胞室、自动载物台和 sCMOS 相机进行光学设置。（C） NMJ 培养物光刺激视频的批处理算法。（D） MATLAB 代码生成的视频的代表帧和相应的收缩性轨迹图。视频中闪烁的蓝色框和图表中的垂直线表示蓝光刺激发生的时间。

图 2.用于生成 3D NMJ 的共培养系统。（A） 微流控平台示意图。（B） 开孔 PDMS 生物反应器示意图。（C） 微流体平台中受支配的骨骼肌组织。（D） 开孔生物反应器中的神经支配组织。比例尺 0.5 毫米。

表 1.肌源性和神经培养基配方。有组织的培养基生长因子和补充剂清单。