来源：Liberman, M., 等，人源神经肌肉接头光遗传学模型的构建与表征。J. Vis. Exp. (2022)。
本视频展示了一种评估功能性神经肌肉接头的方法。通过使用包含肌肉组织和运动神经元的生物反应器，并结合荧光显微镜技术，对神经元中的光敏通道进行刺激，从而产生电信号，引发肌纤维收缩。
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方法文章
通过同步光学刺激与视频记录评估功能性神经肌肉接头
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。
1. 生物反应器准备
- 制作生物反应器模具
- 从补充的CAD文件中下载生物反应器的计算机辅助设计（CAD）文件，或创建自定义设计。
- 使用计算机辅助制造（CAM）软件从3D模型生成数控（CNC）加工路径。
- 使用数控铣床加工聚甲醛（acetal）模具。
- 生物反应器的制备
- 将聚二甲基硅氧烷（PDMS）的基础剂与固化剂按10:1的比例混合（每4个平台/模具使用77 g混合物）。
- 将混合物放入真空腔室，关闭所有阀门，开启真空泵，脱气至少30分钟，直至无气泡残留。将混合物倒入模具中，并将模具置于真空腔室内继续脱气1小时。
- 用模具的上半部分以正确方向盖合模具。在中心位置放置一根六角钢棒，并在两侧夹紧。
- 用PDMS重新填充顶部空隙。
- 将模具置于65 °C烘箱中固化至少4小时。
- 待冷却至室温后，将平台从模具中取出。
- 使用超声波清洗机对装置进行清洗，依次使用洗洁精、400 mL 100%异丙醇和蒸馏水，每次清洗1小时。
- 在65 °C下干燥过夜。
- 将玻璃盖玻片浸泡在1%非离子型聚醇表面活性剂中30分钟，确保盖玻片不重叠，以便均匀包被。
- 用蒸馏水充分冲洗，并在65 °C下干燥过夜。
- 使用等离子清洗机对玻璃盖玻片和PDMS平台进行处理，氧气流量为6 L/min，功率调至高，处理1–2分钟。处理后，立即通过将PDMS压在盖玻片上至少30秒，使两者键合。
- 在接种细胞前，对键合后的装置进行高压灭菌处理。
2. 构建光学刺激装置
- 使用30 mm笼式立方体系统，将一块573 nm二向色镜安装在立方体中心。将一个红色627 nm LED（发光二极管）与一块594 nm长通激发滤光片耦合，并将其安装在立方体的顶面，使LED朝向镜面。然后将一个蓝色488 nm LED与一块546 nm短通激发滤光片连接，并安装在立方体的相邻侧面，使LED朝向镜面，如图1A示意图所示。
- 在笼式立方体底部安装一个环控虹膜光阑，以调节照明区域的大小。
- 使用T-Cube LED驱动器为每个LED供电，并通过Arduino Uno Rev3控制板进行控制。将LED驱动器的侧边输入端连接至电源插头，中间输出端连接至Arduino，侧边输出端直接连接至LED。
- 通过USB线缆将Arduino Uno连接至计算机。
- 从GitHub链接（https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis）下载相关文件。
- 打开GitHub文件夹中的“Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino”文件。
- 设置起始参数：步数 = 30；起始频率 = 0.5；终止频率 = 3；脉冲长度 = 100。
- 确保引脚输出4分配给蓝色LED驱动器，引脚输出2分配给红色LED驱动器。检查LED驱动器的中间导线是否已连接至接地端和相应的引脚输出端。
- 编译并将“Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino”程序加载到Arduino中。
- 将每个LED驱动器连接至对应的通道。
3. 细胞培养设置（第 -21 至 0 天）
- 原代骨骼肌细胞
- 解冻并扩增原代骨骼肌成肌细胞（购自 Cook Myosite），使用肌强直性生长培养基（含补充剂）最多传代六次。将细胞维持在设定为 37 °C 和 5% CO2 的培养箱中。
- 每 2 天更换一次培养基。
- 当细胞融合度达到约 60% 时，使用 0.05% 胰蛋白酶-EDTA（1×，37 °C 下作用 5 分钟）进行传代。收集解离的细胞，并加入新鲜培养基以中和胰蛋白酶。
- 在 300 × g 条件下离心细胞，吸除细胞沉淀上方的上清液。
- 用 MGM 重悬细胞，按 1:3 比例接种，每三层培养瓶加入 60 mL。
- ChR2-hiPSC
注意：本研究中使用的所有细胞系均按照美国纽约哥伦比亚大学的机构指南创建和使用。在本方案中，通过 CRISPR-Cas9 基因组编辑技术（采用先前描述的方法18）生成表达 ChR2 的 hiPSCs，但任何稳定的光遗传学细胞系（如慢病毒、piggyBac 等）均可以相同方式使用。选择在 iPSCs 和运动神经元中均能组成型表达的启动子（CAG）。如先前发表的研究所述，这些细胞具有健康的核型。- 用 DMEM/F12 按 1:80 稀释的可溶性基底膜基质溶液以每孔 1 mL 包被 6 孔板，并在室温下孵育 1 小时。
- 在包被好的 6 孔板中加入 2 mL 无饲养层细胞培养基（iPSC 培养基）接种 iPSCs，每隔一天更换 2 mL 培养基，每 5–7 天传代一次。将细胞维持在设定为 37°C 和 5% CO2 的培养箱中。
- 传代
- 将干细胞与 1 mL 无酶干细胞释放试剂孵育 4 分钟，随后使用宽口 P1000 移液器进行机械剪切以实现解离。
- 在包被的 6 孔板中，每孔加入 2 mL 含 2 μM 盐酸Y-27632 的 iPSC 培养基，按 1:24 或 1:48 的比例接种细胞。
4. 骨骼肌组织接种（第 -3 天）
- 使用自动细胞计数器分离并计数 30 × 10⁶ 个成肌细胞。
- 将成肌细胞重悬于 I 型胶原蛋白（3 mg/mL）与溶解的基底膜基质的 4:1 混合液中（800 μL 胶原混合液 + 200 μL 基底膜基质，终体积为 1 mL）。配制胶原成分时，加入配套的中和试剂（胶原蛋白与中和试剂按 9:1 混合），并用 1× PBS 稀释至终体积 800 μL。
- 向生物反应器的每个肌肉腔室中加入 15 μL 细胞-胶原悬浮液，使用移液枪头确保将悬浮液均匀覆盖在两个支柱上（图 2）。
- 将细胞-凝胶混合物在 37 °C 下聚合 30 分钟，随后向每个生物反应器孔中加入 450 μL 肌管生长培养基。
- 3 天后（待凝胶收缩完成后），开始诱导肌管分化。
5. 肌管分化（第0-14天）
- 通过将组织更换为 450 μL 融合诱导培养基（FS，表 1）开始肌管融合，持续 7 天，每隔一天更换一次培养基。
注意：建议在 hiPSCs 开始运动神经元分化的同时启动肌管分化，以便在两种细胞类型的分化周期结束时进行运动神经元接种。 - 第 7 天，将培养基更换为 450 μL 成熟培养基 Ia（MMIa，表 1）。
- 第 9 天，更换为 450 μL 成熟培养基 Ib（MMIb，表 1）。
- 第 11 天，将培养基更换为 450 μL NbActiv4。此后每 2 天更换一次培养基，直至接种运动神经元（步骤 7）。
6. 运动神经元分化（第0-14天）
- 第0天，将4 × 106个ChR2- hiPSCs转移至含15 mL运动神经元悬浮培养基（MSCM，表1）的超低吸附培养皿中。在MSCM中添加3 μM CHIR99021、0.2 μM LDN193189、40 μM SB431542水合物和5 μM Y-27632二盐酸盐。
- 第2天，使用37 μM可逆滤网分离神经球（NS），并将其重悬于含3 μM CHIR99021、0.2 μM LDN193189、40 μM SB431542水合物和0.1 μM视黄酸的15 mL MSCM中。自第2天起，无需显微镜即可在培养皿中观察到神经球。
- 第4天，将细胞及培养基转移至50 mL离心管中，静置使神经球沉降至管底（5分钟）。吸除上清液，并将细胞重悬于15 mL MSCM中，该培养基需添加0.5 μM SAG、0.2 μM LDN193189、40 μM SB431541和0.1 μM视黄酸。
- 第7天，重复步骤6.3，但将细胞重悬于15 mL含0.5 μM SAG和0.1 μM视黄酸的MSCM中。
- 第9天，重复步骤6.3，但将细胞重悬于15 mL含10 μM DAPT的MSCM中。
- 第11天，重复步骤6.3，但将细胞重悬于15 mL含20 ng/mL BDNF和10 ng/mL GDNF的MSCM中。
- 第14天，将运动神经元接种至实验平台中。
7. 在生物反应器中接种运动神经元聚集体（第14天）
- 制备2 mg/mL I型胶原蛋白与Matrigel的4:1凝胶混合物（800 μL胶原蛋白混合物 + 200 μL Matrigel，终体积为1 mL）。对于胶原蛋白组分，加入配套的中和剂（胶原蛋白与中和剂按9:1比例混合），并用1× PBS稀释至终体积为800 μL。
- 使用400 nm细胞筛筛选较大的神经球，并将其重悬于凝胶混合物中。
- 吸除储液池中的培养基，并小心吸除神经球孔道中的培养基（图2）。
- 向神经球通道中加入15 μL凝胶混合物。
- 用10 μL移液器吸取10 μL凝胶，然后挑取一个神经球。
- 将神经球（NS）置入神经球通道中，并确保其位于腔室内。在释放剩余凝胶的同时缓慢提起移液器。若不确定神经球是否已正确放置，可使用显微镜检查其位置。
- 在37 °C条件下孵育30分钟，使凝胶完成聚合。
- 向储液池中加入450 μL NbActiv4培养基，补充20 ng/mL BDNF和10 ng/mL GDNF。
- 每隔一天更换一次培养基，以促进神经球向肌肉组织的轴突生长。
8. 神经肌肉接头功能的同步光刺激与视频记录（第24天及以上）
- 进行成像时，使用配备科学级互补金属氧化物半导体（sCMOS）相机的倒置荧光显微镜。
- 将相机软件的像素合并设置为2×2，曝光时间为20 ms，滚动快门开启，读出速率为540 MHz，动态范围：12位 & 增益1，传感器模式：重叠模式（overlap）。
- 使用显微镜上的2倍物镜对微组织进行成像。
- 将活细胞培养室（37 °C，5% CO2）安装到显微镜载物台上。
- 选择包含神经支配的骨骼组织的感兴趣区域（ROI），以减小文件大小和处理时间。
- 在样品与成像物镜之间放置一个594 nm长通发射滤光片，以滤除来自相机的蓝光脉冲。
- 将含有4个生物反应器（共24个组织）的矩形4孔板放入活细胞培养室中。
- 点击 实时预览（Live View），将图像居中并对焦至目标感兴趣区域。
- 从GitHub文件夹（https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis）上传自定义宏代码，以控制载物台位置、Arduino板和视频采集。
- 将输出视频文件命名为：day_组织组别_组织名称_实验名称.nd2。
- 运行宏代码，设置载物台上所需的X、Y坐标，并以每秒50帧的速度采集包含1700帧的快速时间序列图像。
- 成像后更换培养基，并将样品放回培养箱。两次成像之间至少间隔24小时，以避免组织疲劳。
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结果
图1. 神经肌肉接头（NMJ）功能的刺激、记录与分析。 （A）LED装置及光路示意图。（B）光学装置，包含倒置显微镜、活细胞培养室、自动载物台和sCMOS相机。（C）用于批量处理NMJ培养物光刺激视频的算法流程。（D）由MATLAB代码生成的视频代表性帧及其对应的收缩力变化曲线图。视频中的闪烁蓝色框和图中的垂直线表示蓝光刺激发生的时间点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细胞 | |||
| SkMDC | Cook Myosite | P01059-14M | |
| 培养基与添加剂 | |||
| 高级DMEM/F12 | 赛默飞世尔科技 | 12634-020 | |
| 牛血清白蛋白溶液 | 默克密理博 | A9576-50ML | |
| G-5 补充剂（100X） | 赛默飞世尔科技 | 17503-012 | |
| 遗传霉素选择性抗生素（G418 硫酸盐）（50 mg/mL） | ThermoFisher Scientific | 10131-035 | |
| 胰岛素，重组人源 | 默克生命科学 | 91077C-100MG | |
| Matrigel | 康宁 | 354277 | |
| mTeSR Plus | 干细胞技术 | 100-0276 | |
| MyoTonic 生长培养基试剂盒 | Cook Myosite | MK-4444 | |
| N-2 补充剂 | 赛默飞世尔科技 | 17502-048 | |
| NBactiv4 500 mL | BrainBits LLC | Nb4-500 | |
| Neurobasal 培养基 | 赛默飞世尔科技 | 21103-049 | |
| Neurobasal-A 培养基 | 赛默飞世尔科技 | A13710-01 | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | P2443 | |
| ReLeSR | 干细胞技术 | 5872 | |
| 塑料器皿 | |||
| 30 mm 笼式立方体系统 | ThorLabs | CM1-DCH, CP33, ER1-P4 和 ER2-P4 | |
| 37 µm 可逆滤网，大型 | 干细胞技术 | 27250 | |
| 546 nm短通激发滤光片 | Semrock | FF01-546/SP-25 | |
| 573 nm 二向色镜 | Semrock | FF573-Di01–25x36 | |
| 594 nm 长通发射滤光片 | Semrock | BLP01-594R-25 | |
| 594 nm 长通激发滤光片 | Semrock | BLP01-594R-25 | |
| 蓝色（470 nm）Rebel LED，安装于 SinkPAD-II 10 mm 方形基座 - 700 mA 下光通量为 65 流明 | LuxeonStarLEDs | SP-05-B4 | |
| Carclo 29.8° 雾面 10 mm 圆形光束光学件 - 集成支脚 | Luxeon Star LED | 10413 | |
| Corning 60 mm 超低吸附培养皿 | Corning | 3261 | |
| 散热器 | Luxeon Star LED | LPD-19-10B | |
| 光学 | |||
| pluriStrainer 400 µm，25个装，无菌 | PluriSelect | 43-50400-03 | |
| pluriStrainer 500 µm，25 个装，无菌 | PluriSelect | 43-50500-03 | |
| 红光（627 nm）Rebel LED，安装于 SinkPAD-II 10 mm 方形基座 - 700 mA 下光通量为 65 流明 | Luxeon Star LED | SP-05-R5 | |
| 环形驱动虹膜光圈 | ThorLabs | SM1D12D | |
| T-Cube LED 驱动器 | ThorLabs | LEDD1B, KPS101 | |
| 霉菌 | |||
| 带内螺纹的六角立柱，3 1/2" 10-32，半螺纹 1/2" | 麦克马斯特 | 91920A046 | |
| 低剖面C形夹 | 麦克马斯特 | 1705A12 | |
| 生长因子 | |||
| 腺苷3′,5′-单磷酸 | 默克生命科学 | A9501-1G | |
| CHIR 99021，10 mg | Tocris | 4423-10 | |
| DAPT 10 mg | R&D 系统 | 2634-10 | |
| 人CNTF，研究级，5 µg | Miltenyl Biotec | 130-096-336 | |
| 人源玻璃连接蛋白蛋白，CF | R&D 系统 | 2349-VN-100 | |
| 人源玻璃连接蛋白蛋白，CF | R&D 系统 | 2349-VN-100 | |
| IGF1 重组人蛋白 | 赛默飞世尔科技 | PHG0078 | |
| 小鼠层粘连蛋白，天然 | 赛默飞世尔科技 | 23017015 | |
| 重组人Agrin蛋白 | R&D系统 | 6624-AG-050 | |
| 重组人GDNF蛋白，CF 50μg | R&D系统 | 212-GD-050/CF | |
| 重组人神经营养因子3 100 μg | 细胞科学 | CRN500D | |
| 重组人神经营养素-4 | 细胞科学 | CRN501B | |
| 重组人音猬因子/Shh (C24II) N-末端 | R&D 系统 | 1845-SH-100 | |
| 重组人/小鼠/大鼠 BDNF 50 μg | Peprotech | 450-02 | |
| 视黄酸，50 mg | 默克生命科学 | R2625-50 | |
| SAG 激活平滑受体激动剂 | 默克生命科学 | 566660 | |
| SB431542 10 mg | 干细胞技术 | 72234 | |
| StemMACS LDN-193189 | Miltenyl Biotec | 130-103-925 | |
| 人血浆来源的玻璃粘连蛋白 | 默克生命科学 | V8379-50UG | |
| Y-27632 二盐酸盐 | Tocris | 1254 | |
| 抗体 | |||
| α-肌动蛋白结合蛋白单克隆抗体（小鼠 IgG1） | Abcam | ab9465 | |
| 胆碱乙酰转移酶 (ChAT) (山羊) | Millipore | AB144P | |
| 结蛋白单克隆抗体（小鼠 IgG1） | Dako | M076029-2 | |
| 肌球蛋白重链（MHC）（小鼠IgG2b） | DSHB | MF20 | |
| 仪器设备 | |||
| Arduino Uno R3 | Arduino | A000066 | |
| 自动载物台 | 应用科学仪器 | MS-2000 XYZ | |
| 等离子体清洗仪扩展装置 | Harrick Plasma | PDC-001（115V） | |
| Invitrogen Countess 自动细胞计数仪 | Marshal Scientific | I-CACC | |
| IX-81 倒置荧光显微镜 | Olympus | IX-ILL100LH | |
| 系列阶段顶部培养箱系统 | Tokai Hit STX | TOKAI-HIT-STXG | |
| Zyla 4.2 sCOMS 相机 | Andor Technology | ZYLA-4.2P-CL10 | |
| 软件 | |||
| Arduino 软件（IDE） | Arduino | IDE 1.8.19 | |
| Mastercam | Mastercam | Mastercam for Solidworks | |
| Matlab | Matlab | R2021b | |
| NIS元素 | 尼康 | 基础研究 | |
| Solidworks 3D CAD | Solidworks | Solidworks 标准版 |
