从神经元细胞中提取蛋白质

摘要

来源:Shani， T. 等人。 实时测量运动神经元样 NSC-34 细胞内核质转运的检测。J. Vis. Exp.（2017 年）

该协议概述了从神经元癌细胞中提取蛋白质。用缓冲液洗涤细胞，并通过酶和机械破碎裂解。离心后收集提取的富含蛋白质的上清液。

方案

1. 细胞系制备

1. 解冻储存在液氮容器中的大约 1,000,000 个小鼠神经母细胞瘤脊髓细胞（NSC-34 细胞）。使用 37 °C 水培养箱，直到细胞完全解冻。
2. 添加新鲜、温暖的培养基（含有 10% 胎牛血清 （FBS）、1% L-谷氨酰胺和 1% pen-strep 抗生素的 DMEM 培养基）。
3. 将解冻的细胞 （SL16R） 以 500 x g 离心 5 分钟，形成细胞沉淀。弃去培养基，加入 1 mL 新培养基用于细胞重悬。
4. 将重悬的细胞放入 15 mL 培养瓶中，再加入 5 mL 培养基。将细胞在 37 °C 下加入 5% CO₂ 的无菌培养箱中孵育过夜。
5. 同时，将 8 个未涂层的盖玻片（盖玻片:12 mm，0.13-0.17 mm 厚）放入 60 mm 培养皿中，并使用 70% 乙醇消毒并暴露在紫外线下 30 分钟直至干燥。向每个培养皿中加入培养基，并丢弃以洗去残留的乙醇。
6. 在细胞达到约 90% 汇合度（每个培养瓶约 600 万个细胞）后，向细胞中加入胰蛋白酶缓冲液（2.5 g 胰蛋白酶和 0.2 g EDTA 溶于 1 L Hanks 平衡盐溶液中），以使贴壁细胞解离><。 注:NSC-34 细胞很敏感，在使用培养基解离之前，只需要 15 秒的胰蛋白酶缓冲液孵育和 1 分钟的额外无胰蛋白酶孵育。
7. 将细胞接种到已经含有盖玻片的 60 mm 培养皿上，其中含有 3 mL 培养基，每个培养皿约 350,000 个。将它们在培养箱中放置 24 小时，以使细胞附着在盖玻片上。

2. 蛋白表达验证

1. 将含有来自每个实验组的残留细胞（上述实验中未使用的）的 60 mm 培养皿置于冰上。
2. 处理培养基，用 PBS 洗涤细胞两次，稀释并洗涤剩余的培养基。
3. 用 200-400 μL 含有 PBS、0.5% Triton 和蛋白酶抑制剂混合物片剂 （PI） 的裂解缓冲液处理细胞。使用细胞刮刀刮擦。
4. 将细胞收集在微量离心管中的裂解缓冲液中，并在冰下用匀浆器以 4,000 rpm 匀浆 1 分钟。
5. 将匀浆细胞以 2,500 x g 离心 10 分钟。收集上清液，使用 Bradford 测定法定量蛋白质浓度，并储存在 -20 °C 直至使用。
6. 收集 30 至 70 μg 总蛋白（取决于蛋白质）并将其加载到 SDS-PAGE 凝胶中，以使用免疫印迹测定法检测蛋白质表达。

材料