神经元细胞中蛋白质的提取

摘要

来源：Shani, T., 等 在运动神经元样 NSC-34 细胞中实时测量核质运输的检测方法。J. Vis. Exp. (2017)

本方案概述了从神经元癌细胞中提取蛋白质的步骤。首先用缓冲液洗涤细胞，然后通过酶解和机械破碎的方法使细胞裂解。离心后收集富含蛋白质的上清液。

方案

1. 细胞系制备

1. 从液氮容器中取出约 1,000,000 个冻存的小鼠神经母细胞脊髓细胞（NSC-34 细胞），在 37 °C 水浴孵育器中解冻，直至细胞完全融化。
2. 加入新鲜预热的培养基（含 10% 胎牛血清（FBS）、1% L-谷氨酰胺和 1% 青霉素-链霉素抗生素的 DMEM 培养基）。
3. 将解冻后的细胞（SL16R）在 500 × g 条件下离心 5 分钟，形成细胞沉淀。弃去上清液，加入 1 mL 新鲜培养基重悬细胞。
4. 将重悬的细胞转移至 15 mL 培养瓶中，并额外加入 5 mL 培养基。将细胞置于含 5% CO₂、37 °C 的无菌孵育箱中过夜培养。
5. 同时，将 8 个未包被的盖玻片（盖玻片：直径 12 mm，厚度 0.13–0.17 mm）放入 60 mm 培养皿中，用 70% 乙醇处理并暴露于紫外光下 30 分钟进行灭菌，直至完全干燥。向每个培养皿中加入培养基并更换一次，以去除残留的乙醇。
6. 当细胞生长至约 90% 汇合度（每瓶培养瓶约含 600 万细胞）时，向培养瓶中加入胰蛋白酶缓冲液（每 1 L Hanks 平衡盐溶液中含 2.5 g 胰蛋白酶和 0.2 g EDTA），使贴壁细胞解离。
   注意：NSC-34 细胞较为敏感，仅需胰蛋白酶缓冲液孵育 15 秒，随后在不含胰蛋白酶的条件下继续孵育 1 分钟，再用培养基进行解离操作。
7. 将细胞以每皿约 350,000 个、加入 3 mL 培养基的条件接种至已放置盖玻片的 60 mm 培养皿中。放入孵育箱培养 24 小时，使细胞充分贴附于盖玻片上。

2. 蛋白质表达验证

1. 将各实验组未用于上述实验的残留细胞置于冰上，放入60 mm培养皿中。
2. 弃去培养基，用PBS洗涤细胞两次，以稀释并去除残留的培养基。
3. 加入200–400 µL裂解缓冲液（含PBS、0.5% Triton和蛋白酶抑制剂混合片剂（PI））处理细胞，并用细胞刮刀刮取细胞。
4. 将裂解液中的细胞收集至微量离心管中，在冰上以4,000 rpm使用匀浆器匀浆1分钟。
5. 将匀浆后的细胞样品在2,500 × g离心10分钟，收集上清液，采用Bradford法测定蛋白浓度，并于-20 °C保存备用。
6. 根据目标蛋白的不同，取30–70 µg总蛋白上样，进行SDS-PAGE凝胶电泳，随后通过免疫印迹法检测蛋白表达水平。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
小鼠运动神经元样杂交细胞系 (NSC-34)	tebu-bio	CLU140-A
DMEM 4.5g/L L-葡萄糖	Biological Industries	01-055-1A
FBS 欧洲级	Biological Industries	04-007-1A
SL 16R 离心机	Thermo Scientific	75004030
Thermo Forma Series ii 水套式 CO₂ 培养箱	Thermo Scientific	3111
盖玻片 直径12mm，厚度0.13–0.17mm	Bar Naor LTD
Axiovert 100 倒置显微镜	Zeiss
Leptomycin B	Sigma	L2913
PBS	Biological Industries	02-023-1A
匀浆器电机/控制器/卡盘/90度夹具	Glas-Col	099C K5424CE
MicroCL 17R 制冷离心机	Thermo Scientific	75002455