星形胶质细胞培养物中细胞表面蛋白与胞内蛋白的分离

摘要

来源：Tham, D. K. L.，等。利用生物素标记法测定原代星形胶质细胞培养物中蛋白质的细胞表面表达及内吞速率。J. Vis. Exp. (2017)。

本视频演示了从星形胶质细胞培养物中分离细胞表面蛋白和细胞内蛋白的方法。将星形胶质细胞培养物置于冰上以抑制内吞作用，随后用生物素化试剂标记细胞表面蛋白。细胞裂解后释放出生物素标记的细胞表面蛋白和未标记的细胞内蛋白。最后，使用链霉亲和素包被的磁珠将生物素标记的细胞表面蛋白与细胞内蛋白分离。

方案

1. 通过生物素标记法测定星形胶质细胞表面蛋白的相对表达水平

注意：此处，我们以生物素化技术的应用为例，说明其在研究细胞外基质分子层粘连蛋白（laminin）对水通透性通道蛋白水通道蛋白-4（AQP4）在细胞表面定位的影响中的作用。本实验所需的特殊材料包括磺基-NHS-LC-生物素（sulfosuccinimidyl 6-(biotinamido) Hexanoate）和链霉亲和素-琼脂糖树脂（见材料表）。

1. 使用该方法，在检测前约2周制备皮质星形胶质细胞的培养物，并在75 cm² 透气培养瓶中进行培养。当星形胶质细胞达到80 - 90%融合度时，用0.05%胰蛋白酶将其从培养表面解离，然后以1:3比例传代。
2. 在检测前48小时，当细胞再次达到80 - 90%融合度时，将星形胶质细胞以1:3比例传代（考虑培养格式的改变）至60 mm细胞培养皿中，使其在实验当天融合度超过>70%。确保细胞在各培养皿之间均匀分布。
3. 在检测前16小时，将层粘连蛋白用移液器加入培养基中，使其终浓度为24 nM，并在37 °C下孵育。
4. 在检测前立即配制以下缓冲液，并置于冰上或冷藏：CM-PBS（含100 mg/L MgCl₂∙6H₂O 和100 mg/L CaCl₂ 的1×磷酸盐缓冲液[PBS]，pH 7.4）、生物素缓冲液（CM-PBS中含0.5 mg/mL sulfo-NHS-LC-生物素）、淬灭缓冲液（CM-PBS中含50 mM NH₄Cl）、裂解缓冲液（25 mM Tris，pH 7.4，25 mM甘氨酸，150 mM NaCl，5 mM乙二胺四乙酸[EDTA]，1% Triton X-100，1×蛋白酶抑制剂混合物）、3×上样缓冲液（150 mM Tris，pH 6.8，6%十二烷基硫酸钠[SDS]，30%甘油，300 mM二硫苏糖醇 [DTT] 和0.01%溴酚蓝）以及洗涤缓冲液（10 mM Tris [pH 7.4]，1.5 mM EDTA，150 mM NaCl，1% Triton X-100，1×蛋白酶抑制剂混合物）。
5. 将盛有星形胶质细胞培养物的培养皿从培养箱中取出，并弃去培养基。
6. 用4 mL预冷的CM-PBS洗涤细胞三次，并将培养皿置于碎冰上。
7. 向每孔中加入2 mL生物素缓冲液，轻轻前后倾斜培养皿数次以确保完全覆盖。冰上放置30分钟。
8. 用抽吸法移除生物素缓冲液，并替换为4 mL淬灭缓冲液。冰上放置10分钟。
9. 抽吸淬灭缓冲液，并替换为等体积的相同缓冲液。再次冰上放置10分钟。
10. 弃去淬灭缓冲液，并用4 mL预冷的CM-PBS洗涤细胞三次。
11. 使用细胞刮刀将细胞刮入1 mL预冷的CM-PBS中，并将悬液转移至微量离心管中。
12. 在100 × g条件下离心3分钟以收集细胞沉淀，弃去上清液，并将细胞重悬于500 µL裂解缓冲液中。
13. 将样品置于冰上30分钟，每5分钟涡旋一次，或在4 °C下置于翻转混合仪中孵育。
14. 在4 °C下以14,000 × g离心10分钟，以沉淀去污剂不溶性物质。将上清液转移至新的微量离心管中。
    1. 保留50 µL该裂解液，加入上样缓冲液，并在干式加热器中95 °C加热使其变性；此为“输入”组分，包含生物素标记的细胞表面蛋白以及未标记的胞质蛋白。
15. 使用锋利剪刀剪去移液枪头末端约0.5 cm，以扩大其开口。使用该移液枪头将75 µL链霉亲和素-琼脂糖珠（通常储存于4 °C）转移至裂解液中，并在4 °C下于摇床/振荡器中孵育3小时。
    1. 由于链霉亲和素-琼脂糖通常以体积分数50%珠体悬浮于抗菌溶液中的浆液形式出售，使用前需充分吹打混匀，确保珠体均匀悬浮，然后向每个样品中加入150 µL该悬浮液。
16. 在4 °C下以1500 × g离心30秒，沉淀链霉亲和素-琼脂糖珠。
17. 保留50 µL上清液（加入上样缓冲液，并在水浴或加热块中95 °C变性）；此为“胞内”组分，主要由未生物素化的胞质蛋白组成。
18. 将沉淀的珠体重悬于1 mL洗涤缓冲液中，在4 °C下轻轻摇动3分钟。离心收集珠体（同步骤1.16），弃去上清液。重复此过程4次，以最大限度减少非生物素化胞质蛋白的非特异性结合。
19. 在4 °C下以1500 × g离心30秒沉淀珠体，并弃去上层洗涤缓冲液。加入50 µL 1×上样缓冲液（用裂解缓冲液稀释）。在95 °C下变性，使生物素与链霉亲和素从珠体上释放；该组分应仅包含生物素化的细胞表面蛋白（“细胞表面”组分）。
    1. 通过SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离“输入”、“细胞表面”和“胞内”组分，并进行蛋白质印迹分析。
       注意：尽管本实验中使用了4 - 20%预制梯度凝胶，但对于本研究中感兴趣的蛋白，使用含0.1% SDS的12 - 14%分离胶和4%浓缩胶已足够。应同时使用适当分子量范围的蛋白标准品。需注意，生物素化蛋白的表观分子量有时会出现可观察的上移。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯化铵 (NH4Cl)	Fisher Scientific	A661-500
溴酚蓝	Bio-Rad	#1610404
完全蛋白酶抑制剂混合物	Sigma-Aldrich	11697498001
乙二胺四乙酸二钠二水合物 (EDTA)	Bio-Rad	#1610729
二硫苏糖醇 (DTT)	Bio-Rad	#1610611
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-生物素	Thermo Fisher Scientific	#21335
甘油	Fisher Scientific	BP229-1
甘氨酸	Sigma-Aldrich	G8898
来自Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤基底膜的层粘连蛋白	Sigma-Aldrich	L2020
磷酸盐缓冲液	Gibco/Thermo Fisher Scientific	10010-023
氯化钠 (NaCl)	Fisher Scientific	S271-500	在冰上解冻。
十二烷基硫酸钠 (SDS)	Sigma-Aldrich	862010
氢氧化钠 (NaOH)	Fisher Scientific	S318-100
链霉亲和素琼脂糖树脂	Thermo Fisher Scientific	#20347
吐温X-100	Fisher Scientific	BP151-500