使用生物素衍生物评估靶表面蛋白的内化

Abstract

来源:Tham， D. K. L.， et al.， 使用生物素化确定原代星形胶质细胞培养物中蛋白质的细胞表面表达和内吞速率。J. Vis. Exp. （2017 年）。

该视频演示了一种使用生物素化评估小鼠皮质星形胶质细胞中靶蛋白内化的方法，然后进行细胞裂解、基于链霉亲和素的蛋白质提取、变性和 Western blot 分析，以确认内化成功。

Protocol

所有涉及动物样本的程序均已由适当的动物伦理审查委员会审查和批准。

1. 通过生物素化确定星形胶质细胞中细胞表面蛋白的内化率

注意:在下文中，我们描述了一个典型的脉冲追踪生物素化实验，在本例中用于跟踪 AQP4 在星形胶质细胞中的内吞作用。所需的专用材料包括磺基-NHS-SS-生物素、链霉亲和素-琼脂糖树脂、还原型谷胱甘肽和碘乙酰胺（参见材料表）。

1. 使用上一节中概述的方法在 60 mm 培养皿中制备小鼠皮质星形胶质细胞的培养物。确保细胞在检测当天达到大约 70% 的汇合度，并且每个培养皿包含相同数量的细胞。
2. 测定前，准备以下物质，并置于冰上或冷藏:CM-PBS 或磷酸盐缓冲盐水（1X PBS 中 100 mg/L MgCl₂∙6H₂O 和 100 mg/L CaCl 2，pH7.4），生物素缓冲液（CM-PBS 中的 0.5 mg/mL 磺基-NHS-SS-生物素），还原缓冲液（50 mM 还原型谷胱甘肽、75 mM NaCl 和 75 mM NaOH）， 淬灭缓冲液（50 mM 碘乙酰胺、1% BSA，溶于 CM-PBS 中）、裂解缓冲液（25 mM Tris，pH 7.4、25 mM 甘氨酸、150 mM NaCl 和 5 mM EDTA 或乙二胺四乙酸、1% Triton X-100、1X 蛋白酶抑制剂混合物）、3X 上样缓冲液（150 mM Tris，pH 6.8、6% SDS 或十二烷基硫酸钠、30% 甘油、300 mM DTT 或二硫苏糖醇和 0.01% 溴酚蓝）， 和洗涤缓冲液（10 mM Tris，pH 7.4、1.5 mM EDTA、150 mM NaCl、1% triton X-100、1X 蛋白酶抑制剂混合物）。
3. 制备新鲜细胞培养基（Dulbecco 改良 Eagle 培养基;或补充有 10% 胎牛血清 （FBS）、1% 青霉素/链霉素和 1% L-谷氨酰胺的 DMEM），并将其置于 37 °C 水浴中。
4. 从培养箱中取出星形胶质细胞培养物，并使用抽吸器吸出培养基。
5. 用 4 mL 冷冻的 CM-PBS 洗涤细胞 3 次，然后将培养皿放在碎冰上。
将
6. 3 mL 生物素缓冲液移液到每个培养皿中，来回倾斜培养皿几次以确保缓冲液分布均匀，然后在冰上放置 30 分钟。
7. 吸出生物素缓冲液，并用 5 mL 温热培养基替换。将培养皿在 37 °C 下孵育 15 分钟，然后将第二个培养皿在相同温度下孵育 30 分钟。将另一个培养皿在4°C下作为0分钟样品。
8. 孵育期结束时，丢弃培养基，用 4 mL 冷冻 CM-PBS 洗涤细胞 3 次。用移液管将 6 mL 还原缓冲液吸到细胞上，并在冰上放置 15 分钟。
9. 去除还原缓冲液，用 6 mL 新鲜的还原缓冲液替换。将混合物再放在冰上 15 分钟。
10. 去除还原液，用 6 mL 淬灭缓冲液替换。在冰上放置 15 分钟。
11. 再次重复淬火步骤。
12. 弃去淬灭缓冲液，用 4 mL 冷冻 PBS 洗涤细胞 3 次。
13. 使用细胞提升器，将细胞刮入 1 mL 冷冻 PBS 中，然后将悬浮液转移到微量离心管中。
14. 以 100 x g 离心 3 分钟，沉淀细胞。弃去上清液，将细胞重悬于 500 μL 裂解缓冲液中。
15. 将其在冰上放置 30 分钟，每 5 分钟涡旋一次。或者，将样品放在 4 °C 的端到端旋转器上，持续此持续时间。
16. 将裂解物在 4 °C 下以 14,000 x g 离心 10 分钟以沉淀去污剂不溶性物质，然后将上清液转移到新的微量离心管中。保存 50 μL 这种裂解物，加入上样缓冲液，并在 95 °C 下在干浴中变性;这是"输入"组分，包含生物素化的内吞蛋白和非生物素化蛋白。
17. 使用切割的移液器吸头，向裂解物中加入 150 μL 链霉亲和素-琼脂糖浆液，并在 4 °C 下在摇床/摇床上孵育 3 小时。
18. 通过在 4 °C 下以 1,500 x g 离心 30 秒沉淀链霉亲和素-琼脂糖珠。
将
19. 珠子重悬于 1 mL 洗涤缓冲液中，并在 4 °C 下摇动 3 分钟。沉淀珠子（根据步骤 1.18）并弃去上清液。重复此过程 4 次，以尽量减少非生物素化胞质蛋白的非特异性结合。
20. 通过在 4 °C 下以 1,500 x g 离心 30 秒来沉淀珠子，并丢弃覆盖的洗涤缓冲液。加入 50 μL 1X 上样缓冲液（使用裂解缓冲液稀释）。通过在 95 °C 下变性从珠子中释放生物素和链霉亲和素;该级分应仅包含内化的细胞表面蛋白（"内吞"级分）。
21. 通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE） 分离输入组分、细胞表面组分和未结合组分，并通过蛋白质印迹分析。
    注意:虽然我们在实验中使用了 4 - 20% 的预制梯度凝胶，但 12 - 14% 分离凝胶和 4% 堆积层（每个含有 0.1% SDS）应该足以处理本研究中的目标蛋白质。还应使用适当大小范围的分子量标准品。请注意，生物素化蛋白质的表观分子量有时会出现明显的变化。

Materials