利用生物素衍生物评估靶表面蛋白的内化

摘要

来源：Tham, D. K. L.，等，利用生物素标记法测定原代星形胶质细胞培养物中蛋白质的细胞表面表达及内吞速率。J. Vis. Exp. (2017)。

本视频演示了一种利用生物素标记法评估小鼠大脑皮层星形胶质细胞中靶蛋白内化的实验方法，随后进行细胞裂解、基于链霉亲和素的蛋白提取、变性处理及蛋白质印迹分析，以确认靶蛋白成功内化。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 通过生物素标记法测定星形胶质细胞表面蛋白的内化速率

注意： 下文描述了一项典型的脉冲-追踪生物素标记实验，本实例中用于追踪星形胶质细胞中水通道蛋白4（AQP4）的内吞作用。所需特殊材料包括磺基-NHS-SS-生物素、链霉亲和素-琼脂糖树脂、还原型谷胱甘肽和碘乙酰胺（见材料表）。

1. 按照前文所述方法，在60 mm培养皿中培养小鼠皮层星形胶质细胞。确保在检测当天细胞汇合度约为70%，且每个培养皿中的细胞数量相等。
2. 在检测前立即配制以下缓冲液，并置于冰上或冷藏：CM-PBS或磷酸盐缓冲盐水（含100 mg/L MgCl₂∙6H₂O和100 mg/L CaCl₂的1×PBS，pH 7.4）、生物素化缓冲液（CM-PBS中含0.5 mg/mL sulfo-NHS-SS-生物素）、还原缓冲液（50 mM还原型谷胱甘肽、75 mM NaCl和75 mM NaOH）、淬灭缓冲液（CM-PBS中含50 mM碘乙酰胺和1% BSA）、裂解缓冲液（25 mM Tris，pH 7.4，25 mM甘氨酸，150 mM NaCl，5 mM EDTA或乙二胺四乙酸，1% Triton X-100，1×蛋白酶抑制剂混合物）、3×上样缓冲液（150 mM Tris，pH 6.8，6% SDS或十二烷基硫酸钠，30%甘油，300 mM DTT或二硫苏糖醇，0.01%溴酚蓝）以及洗涤缓冲液（10 mM Tris，pH 7.4，1.5 mM EDTA，150 mM NaCl，1% Triton X-100，1×蛋白酶抑制剂混合物）。
3. 配制新鲜的细胞培养基（DMEM，即Dulbecco改良Eagle培养基，补充10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素和1% L-谷氨酰胺），并将其置于37 °C水浴中预热。
4. 从培养箱中取出星形胶质细胞培养皿，用移液器吸除培养基。
5. 用4 mL预冷的CM-PBS洗涤细胞三次，并将培养皿置于碎冰上。
6. 向每个培养皿中加入3 mL生物素缓冲液，轻轻前后倾斜培养皿数次以确保液体均匀分布，然后在冰上孵育30分钟。
7. 吸除生物素缓冲液，替换为5 mL预温的培养基。将一个培养皿在37 °C孵育15分钟，另一个相同条件的培养皿孵育30分钟，另取一个培养皿保持在4 °C作为0分钟对照样本。
8. 孵育结束后，弃去培养基，用4 mL预冷的CM-PBS洗涤细胞三次。向细胞中加入6 mL还原缓冲液，在冰上孵育15分钟。
9. 移除还原缓冲液，替换为6 mL新鲜还原缓冲液，继续在冰上孵育15分钟。
10. 移除还原液，替换为6 mL淬灭缓冲液，在冰上孵育15分钟。
11. 重复一次淬灭步骤。
12. 弃去淬灭缓冲液，用4 mL预冷的PBS洗涤细胞三次。
13. 使用细胞刮刀将细胞刮入1 mL预冷的PBS中，并将细胞悬液转移至微量离心管中。
14. 在100 × g条件下离心3分钟收集细胞，弃去上清液，用500 µL裂解缓冲液重悬细胞。
15. 将样品置于冰上30分钟，每5分钟涡旋混匀一次。也可选择在此期间将样品置于4 °C的翻转混合仪上混合。
16. 在4 °C、14,000 × g条件下离心10分钟，沉淀去污剂不溶性物质，将上清液转移至新的微量离心管中。保留50 µL此裂解液，加入上样缓冲液后在干式加热器中95 °C变性；此为“输入”组分，包含生物素标记的内吞蛋白和未标记的蛋白。
17. 使用剪口移液枪头，向裂解液中加入150 µL链霉亲和素-琼脂糖悬液，在4 °C摇床上孵育3小时。
18. 在4 °C、1,500 × g条件下离心30秒，沉淀链霉亲和素-琼脂糖珠。
19. 用1 mL洗涤缓冲液重悬珠子，在4 °C轻轻摇动3分钟。按步骤1.18离心收集珠子，弃去上清液。重复此过程共4次，以最大限度减少非生物素化胞质蛋白的非特异性结合。
20. 在4 °C、1,500 × g条件下离心30秒收集珠子，弃去上清洗涤缓冲液。加入50 µL 1×上样缓冲液（用裂解缓冲液稀释）。在95 °C变性以释放生物素和链霉亲和素；此组分应仅包含内化的细胞表面蛋白（“内吞”组分）。
21. 通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离“输入”、“细胞表面”和“未结合”组分，并进行蛋白质印迹分析。
    注意： 尽管本实验中使用了4–20%预制梯度凝胶，但对于本研究中关注的蛋白，使用12–14%分离胶配以4%浓缩胶（均含0.1% SDS）即可满足要求。应同时使用适当分子量范围的蛋白分子量标准。需注意，生物素化蛋白的表观分子量有时会出现可观察到的上移。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A9647-50
溴酚蓝	Bio-Rad	#1610404
完全蛋白酶抑制剂混合物	Sigma-Aldrich	11697498001
乙二胺四乙酸二钠二水合物（EDTA）	Bio-Rad	#1610729
二硫苏糖醇（DTT）	Bio-Rad	#1610611
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Gibco/Thermo Fisher Scientific	11960-044
EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin	Thermo Fisher Scientific	#21331
胎牛血清	Gibco/Thermo Fisher Scientific	16000-044
甘油	Fisher Scientific	BP229-1
甘氨酸	Sigma-Aldrich	G8898
碘乙酰胺	Bio-Rad	#163-2109
L-谷氨酰胺	Gibco/Thermo Fisher Scientific	25030-081
青霉素/链霉素	Gibco/Thermo Fisher Scientific	15140-122
辣根过氧化物酶标记的驴抗兔IgG（H+L）	Jackson ImmunoResearch Laboratories	111-035-045
磷酸盐缓冲液	Gibco/Thermo Fisher Scientific	10010-023
还原型谷胱甘肽	Sigma-Aldrich	G6529
氯化钠（NaCl）	Fisher Scientific	S271-500
十二烷基硫酸钠（SDS）	Sigma-Aldrich	862010
氢氧化钠（NaOH）	Fisher Scientific	S318-100
链霉亲和素琼脂糖树脂	Thermo Fisher Scientific	#20347
兔多克隆抗AQP4抗体	Alomone	AQP-004
Tris碱（Trizma碱）	Fisher Scientific	BP152-1
Tris-HCl	Fisher Scientific	BP153-1
吐温X-100	Fisher Scientific	BP151-500