利用生物素衍生物评估靶表面蛋白的内化

摘要

来源：Tham, D. K. L.，等，利用生物素标记法测定原代星形胶质细胞培养物中蛋白质的细胞表面表达及内吞速率。J. Vis. Exp. (2017)。

本视频演示了一种利用生物素标记法评估小鼠大脑皮层星形胶质细胞中靶蛋白内化的实验方法，随后进行细胞裂解、基于链霉亲和素的蛋白提取、变性处理及蛋白质印迹分析，以确认靶蛋白成功内化。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 通过生物素标记法测定星形胶质细胞表面蛋白的内化速率

注意： 下文描述了一项典型的脉冲-追踪生物素标记实验，本实例中用于追踪星形胶质细胞中水通道蛋白4（AQP4）的内吞作用。所需特殊材料包括磺基-NHS-SS-生物素、链霉亲和素-琼脂糖树脂、还原型谷胱甘肽和碘乙酰胺（见材料表）。

1. 按照前文所述方法，在60 mm培养皿中培养小鼠皮层星形胶质细胞。确保在检测当天细胞汇合度约为70%，且每个培养皿中的细胞数量相等。
2. 在检测前立即配制以下缓冲液，并置于冰上或冷藏：CM-PBS或磷酸盐缓冲盐水（含100 mg/L MgCl₂∙6H₂O和100 mg/L CaCl₂的1×PBS，pH 7.4）、生物素化缓冲液（CM-PBS中含0.5 mg/mL sulfo-NHS-SS-生物素）、还原缓冲液（50 mM还原型谷胱甘肽、75 mM NaCl和75 mM NaOH）、淬灭缓冲液（CM-PBS中含50 mM碘乙酰胺和1% BSA）、裂解缓冲液（25 mM Tris，pH 7.4，25 mM甘氨酸，150 mM NaCl，5 mM EDTA或乙二胺四乙酸，1% ....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A9647-50
溴酚蓝	Bio-Rad	#1610404
完全蛋白酶抑制剂混合物	Sigma-Aldrich	11697498001
乙二胺四乙酸二钠二水合物（EDTA）	Bio-Rad	#1610729
二硫苏糖醇（DTT）	Bio-Rad	#1610611
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Gibco/Thermo Fisher Scientific	11960-044
EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin	Thermo Fisher Scientific	#21331
胎牛血清	Gibco/Thermo Fisher Scientific	16000-044
甘油	Fisher Scientific	BP229-1
甘氨酸	Sigma-Aldrich	G8898
碘乙酰胺	Bio-Rad	#163-2109
L-谷氨酰胺	Gibco/Thermo Fisher Scientific	25030-081
青霉素/链霉素	Gibco/Thermo Fisher Scientific	15140-122
辣根过氧化物酶标记的驴抗兔IgG（H+L）	Jackson ImmunoResearch Laboratories	111-035-045
磷酸盐缓冲液	Gibco/Thermo Fisher Scientific	10010-023
还原型谷胱甘肽	Sigma-Aldrich	G6529
氯化钠（NaCl）	Fisher Scientific	S271-500
十二烷基硫酸钠（SDS）	Sigma-Aldrich	862010
氢氧化钠（NaOH）	Fisher Scientific	S318-100
链霉亲和素琼脂糖树脂	Thermo Fisher Scientific	#20347
兔多克隆抗AQP4抗体	Alomone	AQP-004
Tris碱（Trizma碱）	Fisher Scientific	BP152-1
Tris-HCl	Fisher Scientific	BP153-1
吐温X-100	Fisher Scientific	BP151-500