使用生物素衍生物评估靶表面蛋白的内化

Abstract

来源:Tham， D. K. L.， et al.， 使用生物素化确定原代星形胶质细胞培养物中蛋白质的细胞表面表达和内吞速率。J. Vis. Exp. （2017 年）。

该视频演示了一种使用生物素化评估小鼠皮质星形胶质细胞中靶蛋白内化的方法，然后进行细胞裂解、基于链霉亲和素的蛋白质提取、变性和 Western blot 分析，以确认内化成功。

Protocol

所有涉及动物样本的程序均已由适当的动物伦理审查委员会审查和批准。

1. 通过生物素化确定星形胶质细胞中细胞表面蛋白的内化率

注意:在下文中，我们描述了一个典型的脉冲追踪生物素化实验，在本例中用于跟踪 AQP4 在星形胶质细胞中的内吞作用。所需的专用材料包括磺基-NHS-SS-生物素、链霉亲和素-琼脂糖树脂、还原型谷胱甘肽和碘乙酰胺（参见材料表）。

1. 使用上一节中概述的方法在 60 mm 培养皿中制备小鼠皮质星形胶质细胞的培养物。确保细胞在检测当天达到大约 70% 的汇合度，并且每个培养皿包含相同数量的细胞。
2. 测定前，准备以下物质，并置于冰上或冷藏:CM-PBS 或磷酸盐缓冲盐水（1X PBS 中 100 mg/L MgCl₂∙6H₂O 和 100 mg/L CaCl 2，pH7.4），生物素缓冲液（CM-PBS 中的 0.5 mg/mL 磺基-NHS-SS-生物素），还原缓冲液（50 mM 还原型谷胱甘肽、75 mM NaCl 和 75 mM NaOH）， 淬灭缓冲液（50 mM 碘乙酰胺、1% BSA，溶于 CM-PBS 中）、裂解缓冲液（25 mM Tris，pH 7.4、25 mM 甘氨酸、150 mM Na....

Materials