利用海马神经元评估蛋白质的趋化吸引或排斥活性

摘要

来源：Yamagishi, S. 等，利用离体海马神经元研究蛋白质底物吸引或排斥活性的条带实验。J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了一种利用海马神经元在图案化蛋白区域上评估蛋白活性的方法。神经元在测试蛋白区域表现出排斥现象，而在对照蛋白区域则表现出黏附现象，从而凸显了吸引性或排斥性蛋白活性的作用效果。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 基质的制备

1. 将4-8个硅胶基质在微波炉或电热板上煮沸5分钟，然后在层流条件下干燥1小时（条纹面朝上）。
   注意： 以下操作均应在层流条件下进行。
2. 使用压缩空气吹扫，或用透明胶带粘除基质条纹面上的任何灰尘。保持条纹面清洁，以确保其能牢固地贴附于培养皿表面。
3. 将基质小心地放置于6 cm塑料培养皿上，用手指轻压固定（每个培养皿放置一个基质，条纹面朝下）。避免基质与培养皿之间产生气泡。在培养皿底部标记条纹的位置。
4. 若基质未能成功贴附，请从步骤1.2重新开始。

2. 神经元培养用条带生成与层粘连蛋白包被

1. 通过将Fc标签蛋白（10-50 µg/ml）与荧光染料标记的抗人Fc抗体（1:3比例，30-150 µg/ml）在磷酸盐缓冲液（PBS）中混合，制备荧光标记的重组蛋白（用于注射时每份25 µl [步骤2.2]，用于放置法时每份100 µl [步骤2.2.1]）。然后在室温下孵育30分钟。
2. 使用22号注射器，将上一步（2.1）制备的25 µl重组蛋白通过基质侧面的小孔注入（见图1A、1C和1E中的箭头）。
   1. 或者，将100 µl重组蛋白加入基质顶部的狭缝中，并从小孔（见图1A、1C和1E中的箭头）吸出约一半溶液，使重组蛋白保留在条带区域。
3. 将培养皿置于细胞培养箱中，在37 °C下孵育30分钟。
4. 向顶部狭缝中加入300 µl PBS（图1B），并从基质侧面的小孔（见图1A、1C和1E中的箭头）吸出液体，以去除未结合的重组蛋白。不要完全吸干PBS，以免蛋白干燥。重复此步骤两次（共三次）。
5. 小心取出基质，并立即加入约100 µl对照蛋白（10-50 µg/ml；Fc），覆盖整个条带区域，形成交替涂层。然后将培养皿置于细胞培养箱中，在37 °C下孵育30分钟。
6. 用PBS洗涤培养皿表面三次后，在PBS中加入约100 µl浓度为20 µg/ml的层粘连蛋白进行包被。
   注意：层粘连蛋白应在冰上解冻，以防止凝固。
7. 将培养皿置于细胞培养箱中，在37 °C下孵育1小时。
8. 用PBS洗涤培养皿表面三次，加入培养基。将含培养基的包被培养皿置于37 °C、5% CO₂的培养箱中备用。

3. 从E15.5小鼠胚胎培养海马神经元

1. 通过颈椎脱臼法处死母鼠，并分离三只E15.5胚胎。
2. 用剪刀沿头部正中矢状面剪开皮肤和颅骨，用小勺取出脑组织。将脑组织小心转移至含有3 ml汉克平衡盐溶液（HBSS）的60 mm培养皿中。
3. 使用解剖刀切取包含皮层、海马和纹状体的半球组织（图2A）。随后，仔细剥离脑膜，分离出海马区域，并将分离的海马组织转移至一个含有2 ml HBSS溶液并置于冰上的15 ml离心管中（图2B-C）。从3只胚胎中共收集6个海马，足以用于8个培养皿的神经元培养。
4. 将HBSS溶液替换为胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（trypsin/EDTA）溶液（2 ml），并将离心管置于37 °C水浴中孵育15分钟。
   注意：无需离心，直接吸除HBSS，切勿通过倾斜离心管倾倒去除HBSS溶液。
5. 加入500 µl胎牛血清（FBS）以中和胰蛋白酶活性。
6. 将混合物在100 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，并用2 ml培养基洗涤沉淀。重复此步骤一次。
7. 使用带有大孔的1,000-µl枪头（剪切枪头），在培养基中将海马组织上下吹打10次，以解离组织。
8. 更换为常规（未剪切）的1,000-µl枪头，将已解离的组织上下吹打，获得单细胞悬液。
9. 将细胞悬液通过80–100 µm孔径的细胞筛网，分离单个细胞。
10. 将过滤后的单细胞悬液在150 × g条件下离心5分钟。
11. 用移液器吸除上清液，将沉淀（神经元）重悬于2 ml培养基中。
12. 使用血细胞计数板结合台盼蓝染色计数细胞，以确定细胞密度和活力。随后，将10,000个神经元接种于150 µl培养基中，用于每组条带培养。应小心加入悬液，使其完全覆盖整个条带区域。

结果

图1. 用于制备条纹状蛋白印章的硅胶模具。（A, B）硅胶模具的俯视图。模具尺寸为 30 mm × 25 mm × 5 mm。A图中的白色箭头指示用于注入重组蛋白的小孔（步骤2.2）。B图中的箭头指示一个狭缝，可用于替代方式施加重组蛋白（步骤2.2.1）。（C, D）硅胶模具的底视图。条纹区域的尺寸为 7 mm × 9 mm，每条条纹的宽度为 90 µm。箭头指示一个微小通道，用于注入重组蛋白。（E）模具中线处的矢状面示意图，显示小孔、条纹与狭缝之间的连接关系。箭头指示注射孔。A–C图的比例尺为 500 µm，D图的比例尺为 200 µm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL 离心管	Violamo	1-3500-01
Alexa Fluor 488 山羊抗人 IgG 抗体	Thermo Scientific	A11013
Alexa Fluor 594 驴抗小鼠 IgG 抗体	Thermo Scientific	A-21203	稀释比例 1/500
B27 添加剂	Thermo Scientific	17504-044	稀释比例 1/50
牛血清白蛋白	Sigma	01-2030-2
100 µm 细胞滤筛	BD Falcon	352360
离心机	Kubota	2410
DAKO 笔	DAKO	S2002	可使用其他防水笔替代
一次性手术刀	Feather	2975#11
FBS	Thermo Scientific	10437-028
5 号镊子	Fine Science Tools	11254-20
GlutaMAX	Thermo Scientific	35050-061	稀释比例 1/200
Hamilton 注射器	Hamilton	805N	22 号，50 µL
HBSS	Thermo Scientific	14170-112
人 IgG，Fc 片段	Jackson	009-000-008
层粘连蛋白	Thermo Scientific	23017-015
Neurobasal 培养基	Thermo Scientific	21103-049
PBS	Nacalai	14249-24
青霉素-链霉素	Thermo Scientific	15070-063	稀释比例 1/100
塑料培养皿，60 mm	Thermo Scientific	150288
硅胶基质			可从 Martin Bastmeyer 教授处获取并购买（bastmeyer@kit.edu）
体视显微镜	Olympus	SZ61
枪头，1000 µL	Watson	125-1000S
透明胶带	Tesa	57315	可使用其他胶带替代
台盼蓝，0.4%	Bio-Rad	145-0013
胰蛋白酶/EDTA	Thermo Scientific	25300-054
培养基			Neurobasal 培养基，添加 B27、GlutaMAX 和青霉素-链霉素。