使用海马神经元评估蛋白质的吸引力或排斥活性

摘要

来源:Yamagishi， S. et al.， 条纹测定法，用于研究使用解离的海马神经元的蛋白质底物的吸引力或排斥活性。J. Vis. Exp. （2016 年）

该视频演示了一种使用海马神经元在模式化蛋白质区上评估蛋白质活性的方法。神经元在测试蛋白区表现出排斥力，在对照蛋白区表现出附着力，突出了吸引或排斥蛋白质活性的影响。

方案

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 矩阵的准备

1. 将 4-8 个有机硅基质在微波炉或热板上煮沸 5 分钟，然后在层流下完全干燥 1 小时（条纹面朝上><）。 注意: 应在层流下执行以下程序。
2. 吹气压缩空气或使用透明胶带去除基质条纹面上的任何灰尘。保持条纹面清洁，使其能够牢固地粘附在板表面。
3. 用手指按压（每个培养皿一个基质;条带面朝下），小心地将基质放在 6 厘米的塑料培养皿上。避免在基质和培养皿之间产生气泡。在培养皿的底部标记条纹的位置。
4. 如果矩阵无法连接，请从步骤 1.2 开始重复。

2. 用于神经元培养的条纹生成和层粘连蛋白包被

1. 通过将 Fc 标记的蛋白 （10-50 μg/ml） 和荧光染料偶联的抗人 Fc 抗体（1 比 3:30 μg/ml）混合，制备荧光标记的重组蛋白（注射用各 25 μl [步骤 2.2]或放置方法各 100 μl [步骤 2.2.1]）磷酸盐缓冲盐水 （PBS）。然后，在 RT 下将混合物孵育 30 分钟。
2. 使用 22 G 注射器，通过基质侧面的小孔（图 1A、1C 和 1E 中的箭头）注入 25 μl 上一步 （2.1） 中制备的重组蛋白。
   1. 或者，将 100 μl 重组蛋白放入基质的顶部狭缝中，并从小孔中吸出大约一半的溶液（图 1A、1C 和 1E 中的箭头），以便重组蛋白保留在条纹区域中。
3. 将培养皿在 37 °C 下在细胞培养箱中孵育 30 分钟。
4. 将 300 μl PBS 放入顶部狭缝中（图 1B）并从位于基质侧面的小孔中吸出（图 1A、C 和 E 中的箭头）以去除未连接的重组蛋白。不要完全吸出 PBS，因为蛋白质会变干。重复此步骤两次。（3 次总计）
5. 小心去除基质，并立即加入 ~100 μl 对照蛋白（10-50 μg/ml;Fc） 覆盖整个条带区域，从而创建替代涂层。然后，将培养皿在 37 °C 下在细胞培养箱中孵育 30 分钟。
6. 用 PBS 清洗培养皿表面 3 次后，在 PBS 中涂上 ~100 μl 20 μg/ml 层粘连蛋白。
   注意:层粘连蛋白应在冰上解冻以防止凝固。
7. 将培养皿在细胞培养箱中于 37 °C 孵育 1 小时。
8. 用 PBS 清洗培养皿表面 3 次并添加培养基。将装有培养基的包被培养皿置于 37 °C 的 5% CO₂ 培养箱中直至使用。

3. 从 E15.5 小鼠胚胎中培养海马神经元

1. 通过颈椎脱位对母亲实施安乐死，并分离出三个 E15.5 胚胎。
2. 用剪刀在头部中线矢状处切开皮肤和头骨，然后用小勺子去除大脑。小心地将大脑转移到含有 3 ml Hank 平衡盐溶液 （HBSS） 的 60 毫米培养皿中。
3. 使用手术刀切出半球，包括皮层、海马体和纹状体（图 2A）。然后，通过小心去除脑膜来解剖海马区域，并将解剖的海马组织转移到含有 2 ml HBSS 溶液的 15 ml 离心管中，在冰上（图 2B-C）。从管中的 3 个胚胎中收集 6 个海马体，足以在 8 个培养皿中培养神经元。
4. 用胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（胰蛋白酶/EDTA）溶液（2 ml）替换HBSS溶液，并将试管在37°C下在水浴中孵育15分钟><。 注意:无需离心即可吸出 HBSS，并且不要通过倾斜试管来倒出 HBSS 溶液。
5. 通过添加 500 μl 胎牛血清 （FBS） 来中和胰蛋白酶活性。
将
6. 混合物以 100 x g 离心 5 分钟。去除上清液并用 2 ml 培养基洗涤沉淀。再次重复此步骤。
7. 使用带有大孔（切割尖端）的 1,000 μl 尖端在培养基中上下移液海马体 10 次以分离组织。
8. 更换为常规（未切割）1,000 μl 吸头，上下移液分离的组织以获得单细胞悬液。
9. 通过将单个细胞通过 80-100 μm 网状细胞过滤器来分离它们。
10. 将过滤的单细胞悬液以 150 x g 离心 5 分钟。
11. 通过吸出去除上清液，并将沉淀（神经元）重悬于 2 ml 培养基中。
12. 使用带有台盼蓝染色的血细胞计数器对细胞进行计数，以确定密度和活力。然后，对于每组条纹，在 150 μl 培养基中接种 10,000 个神经元。应小心放置悬浮液以覆盖整个条带区域。

结果

图 1.用于创建条纹蛋白邮票的 Silicon Matrix。（一、二） 硅矩阵的俯视图。基质尺寸为 30 mm x 25 mm x 5mm。A 中的白色箭头表示注入重组蛋白的小孔（步骤 2.2）。B 中的箭头表示交替应用重组蛋白的狭缝（步骤 2.2.1）。（C、D） 硅矩阵的底视图。条纹区域的尺寸为 7 毫米 x 9 毫米。每条条纹的宽度为 90 μm。箭头表示注射重组蛋白的小通道。（E） 基体中线的矢状图示意图，显示了小孔、条纹和狭缝之间的连接。箭头表示注射孔。比例尺在 AC 中为 500 μm，在 D 中为 200 μm。

材料