对小鼠脑部实施创伤性脑损伤

摘要

来源：Zhong, J.，等 利用双光子显微镜对小鼠闭合性颅脑损伤及颅窗模型中荧光蛋白表达进行活体成像。J. Vis. Exp. (2023)

本视频展示了在小鼠中实施创伤性脑损伤（TBI）的方法。暴露颅骨后，标记TBI作用部位。将小鼠置于TBI装置下方，通过提起金属杆并使其自由下落撞击与颅骨接触的冲击头，从而产生冲击损伤。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 重复性创伤性脑损伤（TBI）诱导的实施

注意：TBI 参数根据以往报告进行调整，以往报告中 TBI 冲击仅施加一次。本方案采用相同参数，但将总冲击次数增加至 10 次。

1. 创伤性脑损伤（TBI）设备
   1. 使用定制的便携式设备，按照图1B所示，在小鼠头部右侧施加闭合性颅脑创伤（TBI）（图1A）。
2. 术前准备
   1. 对包括普通剪刀、手术卡尺、弹簧剪、手术镊、蚊式钳、头固定件、纱布和棉签在内的手术器械进行高压灭菌处理。
   2. 术前2小时称量并记录小鼠体重。为减少颅窗植入过程中脑水肿的发生，使用胰岛素注射器向股四头肌注射地塞米松磷酸钠，剂量为4.8 mg/kg [2 mg/mL，通常约为70 µl（需在两个位点注射）]。注射地塞米松后，在开始TBI手术前，按照步骤2.1准备玻璃窗以供后续使用。
   3. 使用75%乙醇对手术台和TBI设备进行消毒。展开一次性无菌手术巾，覆盖在立体定位仪平台的手术台上。打开加热装置和温度监测仪，将目标温度设定为37 °C。
   4. 打开氧气瓶阀门，调节氧气流速至1.5 L/min。开启麻醉机，并将异氟烷浓度设定为3。
      ​注意：100%纯氧有助于动物耐受TBI冲击。
   5. 将小鼠放入诱导室，维持5分钟，以达到完全麻醉状态。
   6. 当小鼠完全麻醉后（即呼吸缓慢而稳定，约每2秒一个周期，并且无尾夹反射），将其从诱导室中取出，并将头部固定于立体定位仪中。
   7. 将麻醉管鼻罩罩住小鼠鼻部。
   8. 在整个手术期间，维持1.5%异氟烷与100%纯氧混合气体，以1 L/min的流速持续麻醉。定期检查呼吸频率，并至少每15分钟进行一次尾部或足趾夹捏测试，以评估麻醉深度。根据需要调整异氟烷浓度，以维持理想的麻醉深度。
3. TBI手术
   1. 使用一次性胰岛素注射器皮下注射布托啡诺（1 mg/kg），并在小鼠眼睛上涂抹眼用软膏。
   2. 先用剪刀1修剪头部毛发，再涂抹脱毛剂1分钟以去除头顶毛发。
      ​注意：脱毛剂在头皮上的作用时间不得超过3分钟，因其具有皮肤刺激性。同时，避免脱毛剂进入小鼠眼睛。
   3. 用纱布和棉签清洁头皮皮肤，然后依次使用75%乙醇和碘伏进行皮肤消毒。重复此过程三次（即乙醇后接碘伏），最后一次使用碘伏后保留在皮肤上。
   4. 再次检查麻醉深度，确保小鼠完全麻醉（即呼吸缓慢而稳定，约每2秒一个周期，并且无尾夹反射）。用手术镊3提起皮肤，在距眼睛后方约3 mm处开始，做一条12–15 mm长的正中切口。
   5. 使用弹簧剪2切除覆盖颅骨左右半球的皮肤。
   6. 暴露颅骨后，用无菌棉签轻轻擦拭并用无菌生理盐水冲洗，以去除骨膜。
   7. 目视检查颅骨状况，确保其完整，仅存在因先前病毒注射手术造成的两个小孔。
   8. 干燥颅骨区域，并标记TBI冲击位点：前囟后方2.5 mm，矢状缝右侧2 mm（图1B）。
   9. 迅速将小鼠从立体定位仪中取出，将其头部置于TBI设备下方的缓冲垫上。
   10. 将冲击头对准已标记的冲击位点。
   11. 通过拉动系绳尼龙线将金属柱提升至小鼠头部上方15 cm处，然后释放，使重物自由下落撞击与颅骨顶部接触的换能杆。施加TBI冲击时切勿触碰小鼠头部。
   12. 将小鼠移至加热毯上，仰卧放置，同时监测其呼吸状态。
   13. 当小鼠从仰卧位自行翻转为俯卧位后，将其放入异氟烷诱导室约5分钟，使用3%异氟烷与100%纯氧混合气体，流速为1.5 L/min。
   14. 当小鼠再次完全镇静（即呼吸缓慢而稳定，约每2秒一个周期，并且无尾夹反射）后，重复步骤1.3.9–1.3.14，共完成10次冲击。
       ​注意：在本研究中，10次TBI冲击可诱导出显著表型且小鼠死亡率较低（数据尚未发表）。可通过增加或减少冲击次数和/或改变重物下落高度来调整参数，以实现不同严重程度的脑损伤。所有参数均需经本地IACUC批准。
   15. 在手术显微镜下检查颅骨，若发现颅骨骨折，则将该小鼠排除出研究。
   16. 对于假手术组，执行与上述相同的操作流程，包括将动物置于冲击头下方，但不施加TBI冲击。
   17. 在第10次TBI冲击后，当小鼠从仰卧位自行翻转为俯卧位时，将其放入异氟烷诱导室约5分钟。随后，按照步骤1.2.6–1.2.8将小鼠头部重新固定于立体定位仪中，以进行下述颅窗植入手术。

结果

图1：TBI装置、TBI撞击部位及窗片制备示意图。 （A）自由落体TBI装置的设备。1：底座，2：支架，3：可调夹具，4：尼龙绳，5：重物下落通道，6：金属重锤柱（50 g），7：撞击头，8：缓冲垫。（B）病毒注射与TBI撞击部位的示意图，坐标位于前囟后方2.5 mm，矢状缝右侧2 mm处。（C）玻璃窗制备示意图。使用光学胶将直径分别为3 mm和5 mm的两片玻璃盖玻片粘合在一起。（D）金属头固定柱与成像腔室的照片。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
可调节精密涂抹刷	Parkell	S379
BD 胰岛素注射器	BD	NDC/HRI#08290-3284-38	5/16" x 31G
聚维酮碘	Purdue	NDC67618-151-17	含 7.5% 聚维酮碘
丁丙诺啡	PAR Pharmaceutical	NDC 42023-179-05
乙醇	Fisher Scientific	04355223EA	75%
加热装置	CWE	TC-1000 Mouse	配备立体定位仪，用于手术过程中维持体温
加热垫	CVS pharmacy	E12107	术后使用的额外加热设备
眼用润滑软膏	Picetal	NDC 46066-753-55
标记笔	Delasco	SMP-BK
蚊式止血钳	CAROLINA	Item #:625314	不锈钢，弯型，5 英寸
脱毛剂	McKesson Corporation	N/A	Nair Hair Aloe & Lanolin 脱毛乳液
普通剪刀 1	Eurostat	eurostat es5-300
普通剪刀 2	World Precision Instruments	No. 501759-G
生理盐水	Bioworld	L19102411PR
弹簧剪刀 1	World Precision Instruments	No. 91500-09	直头
弹簧剪刀 2	World Precision Instruments	No. 91501-09	直头
立体定位平台	KOPF	Model 900LS
手术镊 1	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	Catlog# 0508-5/45-PO	型号 5/45，弯型
手术镊 2	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	catlog# 0103-5-PO	型号 5，直型
手术镊 3	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	catlog# 72912
手术镊 4	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	Catlog# 0508-5/45-PO	型号 5/45，弯型
手术灯	Leica	Leica KL300 LED
Vetbond 组织粘合剂	3M Animal Care	Part Number:014006