微流控芯片内大鼠海马神经元的荧光免疫染色 关键词：微流控芯片，大鼠海马神经元，荧光免疫染色，神经元培养，细胞分隔，轴突，树突，免疫荧光，神经生物学

摘要

来源：Nagendran, T.，等，使用预组装塑料微流控芯片对原代小鼠神经元进行区室化培养。 J. Vis. Exp. (2018)

本视频演示了在微流控芯片内培养的大鼠海马神经元的免疫荧光染色，用于分析神经元的成熟与连接性。

方案

1. 芯片内的荧光免疫染色

1. 在 PBS 中配制 4% 多聚甲醛固定液（4% 多聚甲醛，1 µM MgCl₂，0.1 µm CaCl₂，120 mM 蔗糖）
2. 吸除芯片孔中大部分培养基（切勿使内部腔室干燥）。
3. 立即向轴突和胞体腔室的上层孔中各加入 100 µL 固定液。
4. 1 分钟后，向底部孔中加入 100 µL 固定液。室温下固定 30 分钟。
5. 吸除芯片孔中大部分液体（切勿使内部腔室干燥）。立即向轴突和胞体腔室的上层孔中各加入 150 µL PBS。等待 2 分钟，使 PBS 流入底部孔中。
6. 重复步骤 1.5 两次。
7. 吸除芯片孔中大部分液体，立即向轴突和胞体腔室的上层孔中各加入 150 µL 含 0.25% TritonX-100 的 PBS。静置 15 分钟。
8. 吸除芯片孔中大部分液体，立即向轴突和胞体腔室的上层孔中各加入 150 µL 封闭液（含 10% 正常山羊血清的 PBS）。静置 15 分钟。
   注意：封闭液应根据二抗种类进行选择，例如，若使用驴抗绵羊二抗，则封闭液中应使用驴血清。
9. 吸除芯片孔中大部分液体，立即向轴突和胞体腔室的上层孔中各加入 100 µL 用含 1% 正常山羊血清的 PBS 稀释的一抗（或多种一抗）。覆盖以减少蒸发，室温孵育 1 小时或 4 °C 过夜。
10. 吸除芯片孔中大部分液体（切勿使内部腔室干燥）。立即向轴突和胞体腔室的上层孔中各加入 150 µL PBS。等待 5 分钟，使 PBS 流入底部孔中。
11. 重复步骤 1.10 两次。
12. 吸除芯片孔中大部分液体，立即向轴突和胞体腔室的上层孔中各加入 100 µL 用 PBS 稀释的二抗（或多种二抗）。覆盖以减少蒸发，室温孵育 1 小时。
    注意：请参照二抗产品说明书推荐的稀释比例进行操作。
13. 重复步骤 1.10–1.11。
14. 若在免疫染色后 1 天内进行成像，需保持芯片孔内充满 PBS。若染色后需存放超过 1 天再成像，应将含有芯片的培养皿用封口膜包裹以防止蒸发，并于 4 °C 保存至成像前。
15. 如需长期保存样本，可使用封片剂（例如，Fluoromount-G）。
    1. 吸除芯片孔中大部分液体。使用 1 mL 一次性塑料移液管，向轴突和胞体腔室的上层孔中各加入 2 滴封片剂。
    2. 倾斜芯片以促进封片剂流经通道。5 分钟后，向底部孔中各加入 2 滴封片剂。静置 1 小时后即可成像。
       注意：使用封片剂后，将无法再次对其他靶标进行重染。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
XonaChip	Xona Microfluidics, LLC	XC150	150 µm 长度的微沟槽屏障
XonaChip	Xona Microfluidics, LLC	XC450	450 µm 长度微沟槽屏障
XonaChip	Xona Microfluidics, LLC	XC900	900 µm 长微沟槽屏障
XC预包被	Xona Microfluidics, LLC	XC预包被	随 XonaChips 提供
XonaPDL	Xona Microfluidics, LLC	XonaPDL
Neurobasal 培养基	赛默飞世尔科技	21103049
玻璃巴斯德吸管	Sigma-Aldrich	CLS7095D5X SIGMA
Pierce 16% 甲醛	赛默飞世尔科技	28906
PBS（10×）	赛默飞世尔科技	QVC0508
正常山羊血清	赛默飞世尔科技	16210064
Triton X-100	赛默飞世尔科技	28314
抗vGlut1抗体	NeuroMab	75-066	克隆 N28/9，1:100
Alexa Fluor 二抗	赛默飞世尔科技		17:40
转盘共聚焦成像系统	Andor Technology	CSU-X1，iXon X3 EMCCD	60x 硅油 & 20倍物镜