大鼠皮层神经元中丝状肌动蛋白点状结构的定量分析

本文内容

摘要

本视频演示了对大鼠皮层神经元进行荧光染色以用于显微镜观察的实验步骤。该方法针对F-肌动蛋白和树突蛋白进行标记，以分析神经元的结构完整性并计算F-肌动蛋白密度，这对于研究神经元功能与健康状态至关重要。

方案

1. 荧光标记与免疫细胞化学

注意：原代皮层细胞培养物的免疫荧光标记在玻璃底35 mm细胞培养皿中进行，工作体积为1 ml。

用 pH 7.4 的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗玻璃底培养皿两次。
在室温下用 4% 多聚甲醛固定细胞 15 分钟。
用 PBS 清洗细胞两次，并用含 0.1% Triton X-100 的 PBS 透化处理 5 分钟。
在室温下用 F（丝状）-肌动蛋白特异性染料 AlexaFluor 488 鬼笔环肽（1:40，25 µl 鬼笔环肽溶于 1 ml PBS）处理细胞 20 分钟。
用 PBS 清洗细胞两次，并在室温下用 10% 正常山羊血清封闭 1–2 小时。
将鸡多克隆抗 MAP2（微管相关蛋白 2）抗体（1:2,500）用含 2% 正常山羊血清的 PBS 稀释后，于 4 ⁰C 孵育过夜（O/N）。
孵育结束后，用 PBS 再清洗两次。
将二抗（Alexa Red 594 标记的山羊抗鸡 IgG，1:500）用含 2% 正常山羊血清的 PBS 稀释后，在室温下孵育 2 小时。
用 PBS 清洗后，每皿加入 10 µl 的 Hoechst 染料。
室温孵育 3 分钟，再用 PBS 清洗两次。
注意：标记后的细胞现已准备好进行步骤 2（F-肌动蛋白斑点计数）。
用 100 µl 抗荧光淬灭试剂作为封片剂保存细胞样本，并于 4 ⁰C 避光长期保存。
注意：鬼笔环肽在避光、4 °C 的 PBS 中相对稳定，可维持长达 1 周，且使用抗荧光淬灭封片试剂可有效保持荧光信号。然而，最佳成像效果通常在染色后 1–3 天内获得，因为长期储存可能导致鬼笔环肽逐渐扩散流失。

2. F-肌动蛋白点状结构计数

打开荧光显微镜，切换至20×物镜。启动显微镜软件，设置程序参数为1280×960像素图像尺寸，1×缩放倍数下图像分辨率为0.17 µm/像素。
在绿色（495 nm）或红色（613 nm）荧光通道下采集共标记F-actin/MAP2神经元的图像。
选择5张绿色（F-actin）/红色（MAP2）免疫标记/蓝色（Hoescht）荧光图像，图像中单个神经元的树突分支结构清晰可辨。
在二级树突片段（长度范围25–75 µm）中识别富含F-actin的结构，该区域需具有连续的MAP2免疫荧光信号。
将所选图像区域旋转至水平方向，复制并粘贴为新图像。
对图像进行背景扣除，每个培养皿使用一致的调整参数。
由经过培训的独立观察者手动计数明亮的绿色F-actin斑点，并追踪所选树突片段的长度。将数据导出至电子表格文件。
通过将F-actin标记的斑点总数（N）除以MAP2标记树突的长度（L），计算其密度。数据以每10 µm树突长度上的F-actin斑点数量表示。
注意：纳入分析的F-actin荧光斑点（大小≤1.5 µm）需满足其峰值强度至少高于树突主干染色平均强度的50%。

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材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号
35 mm 玻璃底培养皿，1.5 号盖玻片	MatTek Corporation	P35G-1.5-20-C
DMEM/F12 培养基	Life Technologies	10565-018
聚-L-赖氨酸（Poly-L-Lysine）	Sigma	P9155
多聚甲醛（Paraformaldehyde）	Sigma	P6148
AlexaFluor 488 标记鬼笔环肽（Phalloidin）	Life Technologies	A12379
正常马血清（Normal horse serum）	Life Technologies	26050-070
鸡多克隆抗 MAP2 抗体（Chicken polyclonal anti-MAP2）	abcam	Ab92434
Alexa Red 594 标记的山羊抗鸡 IgG 抗体（Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG）	Life Technologies	A11042
NucBlue 活细胞染色试剂（ReadyProbes 试剂，含 Hoechst 33342）	Life Technologies	R37605
NIS-Elements 软件包	Nikon Instruments
Nikon Eclipse TE2000-E 倒置荧光显微镜（计算机控制）	Nikon Instruments

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