大鼠皮层神经元中丝状肌动蛋白点状结构的定量分析

摘要

来源：Li, H.，等。大鼠皮层神经元中丝状肌动蛋白（F-actin）点状结构的定量分析。J. Vis. Exp. (2016)

本视频演示了对大鼠皮层神经元进行荧光染色以用于显微镜观察的实验步骤。该方法针对F-肌动蛋白和树突蛋白进行标记，以分析神经元的结构完整性并计算F-肌动蛋白密度，这对于研究神经元功能与健康状态至关重要。

方案

1. 荧光标记与免疫细胞化学

注意：原代皮层细胞培养物的免疫荧光标记在玻璃底35 mm细胞培养皿中进行，工作体积为1 ml。

1. 用 pH 7.4 的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗玻璃底培养皿两次。
2. 在室温下用 4% 多聚甲醛固定细胞 15 分钟。
3. 用 PBS 清洗细胞两次，并用含 0.1% Triton X-100 的 PBS 透化处理 5 分钟。
4. 在室温下用 F（丝状）-肌动蛋白特异性染料 AlexaFluor 488 鬼笔环肽（1:40，25 µl 鬼笔环肽溶于 1 ml PBS）处理细胞 20 分钟。
5. 用 PBS 清洗细胞两次，并在室温下用 10% 正常山羊血清封闭 1–2 小时。
6. 将鸡多克隆抗 MAP2（微管相关蛋白 2）抗体（1:2,500）用含 2% 正常山羊血清的 PBS 稀释后，于 4 ⁰C 孵育过夜（O/N）。
7. 孵育结束后，用 PBS 再清洗两次。
8. 将二抗（Alexa Red 594 标记的山羊抗鸡 IgG，1:500）用含 2% 正常山羊血清的 PBS 稀释后，在室温下孵育 2 小时。
9. 用 PBS 清洗后，每皿加入 10 µl 的 Hoechst 染料。
10. 室温孵育 3 分钟....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
35 mm 玻璃底培养皿，1.5 号盖玻片	MatTek Corporation	P35G-1.5-20-C
DMEM/F12 培养基	Life Technologies	10565-018
聚-L-赖氨酸（Poly-L-Lysine）	Sigma	P9155
多聚甲醛（Paraformaldehyde）	Sigma	P6148
AlexaFluor 488 标记鬼笔环肽（Phalloidin）	Life Technologies	A12379
正常马血清（Normal horse serum）	Life Technologies	26050-070
鸡多克隆抗 MAP2 抗体（Chicken polyclonal anti-MAP2）	abcam	Ab92434
Alexa Red 594 标记的山羊抗鸡 IgG 抗体（Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG）	Life Technologies	A11042
NucBlue 活细胞染色试剂（ReadyProbes 试剂，含 Hoechst 33342）	Life Technologies	R37605
NIS-Elements 软件包	Nikon Instruments
Nikon Eclipse TE2000-E 倒置荧光显微镜（计算机控制）	Nikon Instruments