建立小鼠原代小脑颗粒神经元损伤模型

摘要

来源：Laaper, M. 等., 在小鼠原代小脑颗粒神经元中建模神经元死亡与变性。J. Vis. Exp. (2017)。

本视频演示了在小鼠原代小脑颗粒神经元中建立神经元损伤模型的方法。该方法概述了使用NMDA（一种兴奋性神经递质受体激动剂）和甘氨酸（一种共激动剂）诱导神经元损伤的步骤。NMDA和甘氨酸结合于特定的神经元受体，导致受体过度激活，从而引起大量细胞内钙离子内流，最终导致神经元损伤和死亡。

方案

1. 实验准备

注意：以下贮存液可预先配制并保存至使用。

1. 灌流液
   1. 溶解 3.62 g 氯化钠（NaCl）、0.2 g 氯化钾（KCl）、0.069 g 磷酸钠（NaH₂PO₄ ∙ H₂O)，以及500 mL蒸馏水中溶解1.306 g D-(+)-葡萄糖₂然后，向溶液中加入12.5 mL HEPES缓冲液、450 µL 酚红溶液和20 mL 牛血清白蛋白（BSA）V组分。用1 N氢氧化钠（NaOH）调节pH至7.4。
   2. 用 0.22 µm 滤器过滤除菌，4 °C 保存。该溶液可稳定保存 1 周至 10 天。
2. 胰蛋白酶
   1. 配制浓度为 25 g/L 的胰蛋白酶溶液，溶剂为 0.9% 氯化钠。将溶液储存于 -20 °C。
3. 胰蛋白酶抑制剂
   1. 通过将1 g鸡卵清胰蛋白酶抑制剂溶解于100 mL 1 mM HCl中，配制浓度为10 mg/mL的储备液。将该溶液储存于-20 °C。
4. 脱氧核糖核酸酶（DNase）
   1. 将100 mg DNase 1溶解于10 mL无菌水中，配制成10 mg/mL的储存液。将溶液于-20 °C保存。
5. MgSO₄₄
   1. 加入6.02 g硫酸镁（MgSO₄) 加入 50 mL 蒸馏水（H₂O）配制1 M储备液。将溶液于4 °C保存。
6. CaCl₂
   1. 溶解0.735 g氯化钙（CaCl₂∙ 2H₂O) 在 50 mL 蒸馏 H₂O至储存浓度为100 mM。将溶液于4 °C保存。
7. KCl
   1. 将 3.7275 g KCl 溶解于 50 mL 蒸馏 H₂O至1 M的储存浓度。将溶液在4 °C下保存。
8. D-(+)-葡萄糖
   1. 将1.802 g D-(+)-葡萄糖溶解于50 mL蒸馏H₂O至储存浓度为100 mM。将溶液于4 °C保存。
9. 细胞培养基
   1. 按如下方法制备细胞培养基：将5 mL热灭活透析胎牛血清、500 µL 200 mM L-谷氨酰胺、100 µL 50 mg/mL庆大霉素和1 mL 1.0 M KCl加入45 mL滤膜灭菌的含1.125 g/L D-葡萄糖的Eagle最低必需培养基（E-MEM）中，配制成50 mL小脑颗粒神经元（CGN）培养基。培养基储存于4 °C。
10. 阿糖胞苷
    1. 将48 mg胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷溶解于10 mL培养基中，配制成20 mM的储存液。溶液于-20 °C保存。
11. 聚-D-赖氨酸
    1. 为制备 2 mg/mL 的聚-D-赖氨酸储备液，加入 10 mL 无菌 H₂O至20 mg的多聚D-赖氨酸。多聚D-赖氨酸储备液应分装为100 µL每份，于-80 °C保存。
       注意： 以下溶液应在解剖前配制，并在使用前保持于 4 °C。
12. MgSO₄₄ 添加型解剖液
    1. 加入 300 µL 的 MgSO 储存液₄ 至250 mL解剖液中。
13. 胰蛋白酶消化液
    1. 加入100 µL的储存液胰蛋白酶和12 µL的储存液MgSO₄₄ 至10 mL解剖液中。
14. 胰蛋白酶抑制剂溶液 1
    1. 加入 164 µL 原液胰蛋白酶抑制剂、250 µL 原液DNase I 和 12 µL 原液MgSO₄₄ 至10 mL解剖液中。
15. 胰蛋白酶抑制剂溶液 2
    1. 加入1040 µL的储存液胰蛋白酶抑制剂、750 µL的储存液DNase 1和12 µL的储存液MgSO₄₄ 至10 mL解剖液中。
16. CaCl₂ 补充解剖液
    1. 加入10 µL的CaCl储备液₂ 和25 µL的储备MgSO₄₄ 至10 mL解剖液中。
17. 聚-D-赖氨酸包被培养皿
    1. 为包被培养皿，将100 µL聚-D-赖氨酸储备液加入40 mL无菌H₂对于35 mm的Nunc培养皿，加入2 mL稀释的聚D-赖氨酸溶液；对于4孔板，每孔加入300 µL稀释的聚D-赖氨酸溶液。
    2. 让聚-D-赖氨酸静置1小时，然后用4 mL或600 µL无菌H₂O（分别用于35 mm培养皿或4孔板）冲洗各孔₂O. 然后吸除H₂O，并将培养皿室温晾干1小时。

2. 大脑提取与小脑分离

1. 使用剪头剪剪除一只6–7日龄幼鼠的头部。在无菌组织培养罩内进行脑组织的解剖。
2. 取出脑组织时，用镊子夹住头部，用显微解剖剪沿头部前方剪开皮肤，如图1所示。然后使用另一把新的剪刀剪开颅骨，以尽量减少污染风险。用镊子移除覆盖在脑组织上的颅骨，并用镊子或刮匙小心分离并取出脑组织。
   1. 必要时可剪断视神经，以便完整取出脑组织。
3. 将脑组织放入含有MgSO₄的解剖液中，并将溶液和脑组织置于冰上保存。
4. 取出脑组织后，在解剖显微镜下，于含MgSO₄的解剖液中分离小脑，并用精细镊子去除脑膜。将小脑翻转至腹面，确保彻底清除脉络丛。
5. 将分离的小脑收集至一个直径35 mm的培养皿中，内含约1 mL含MgSO₄的解剖液。
6. 将组织切成小块，转移至含有30 mL含MgSO₄的缓冲解剖液的50 mL离心管中。

3. 小鼠小脑颗粒神经元的分离与培养

1. 将含有切碎脑组织的50 mL离心管在644 × g、4 °C条件下离心5分钟。
2. 弃去上清液，加入10 mL胰蛋白酶消化液，然后在37 °C下高速振荡15分钟。
3. 向离心管中加入10 mL胰蛋白酶抑制剂溶液1，轻轻摇晃2分钟。
4. 将离心管在644 × g、4 °C条件下离心5分钟。
5. 弃去上清液，加入2 mL胰蛋白酶抑制剂溶液2，然后转移至15 mL离心管中。
6. 在15 mL离心管中吹打组织直至溶液变浑浊，静置5分钟。
7. 弃去澄清的上清液，并将上清液转移至另一新离心管中，该管内含有1 mL添加了CaCl₂的消化液。
8. 向步骤3.6中沉淀物所在的离心管底部再加入1 mL胰蛋白酶抑制剂溶液2，再次进行吹打，静置5分钟后弃去上清液，并将上清液加入步骤3.7中所收集的上清液管中（即重复步骤3.6–3.7）。重复此过程，直至大部分组织被机械解离。
9. 每1 mL上清液中加入0.3 mL添加了CaCl₂的消化液。
10. 混匀管内内容物，然后在644 × g条件下离心5分钟。
11. 弃去上清液，向沉淀物中加入10 mL新鲜培养基并混匀。
12. 随后可对细胞进行计数，并稀释至1.5 × 10⁶ 个细胞/mL。请注意，通常每个解剖得到的脑组织可获得约1000万个细胞，具体数量取决于胰蛋白酶消化时间和解剖效率。将细胞接种至预先制备的多聚D-赖氨酸包被的培养板中。对于4孔板，每孔接种0.5 mL，即每孔7.5 × 10⁵ 个细胞；对于35 mm培养皿，每皿接种4 mL，即每皿6 × 10⁶ 个细胞。
13. 24小时后，向培养板中加入胞嘧啶-β-阿拉伯糖苷（AraC）以减少胶质细胞污染。每1 mL培养基需加入0.5 µL的20 mM AraC。添加AraC时无需更换培养基。若需将细胞维持培养7–8天，则应在第3天重复一次该处理。
14. 将培养物置于37 °C、5% CO₂的培养箱中培养，自第5天起，每隔2天向每2 mL培养基中补充100 µL 100 mM葡萄糖。无需进行完全换液。

4. 建模神经元损伤

1. 为诱导N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）介导的神经元兴奋性毒性，于7天后 体外，用100 µM NMDA和10 µM甘氨酸处理CGNs 1小时。将所有培养基更换为来自未经处理的平行培养物的条件培养基。该浓度在处理后24小时导致50%的细胞死亡（图2、3线粒体断裂在处理后6-8小时明显可见。

结果

图1：小鼠脑组织的取出及小脑解剖。（A）为提取6-7日龄小鼠的脑组织，使用一对镊子夹住头部，沿虚线用显微解剖剪在前方剪开皮肤。注意仅剪开皮肤和结缔组织，切口过深可能刺破颅骨并损伤脑组织。这三条切口——沿中线的一条直线切口和两条向外弯曲的切口——可使皮肤向后推开，暴露出颅骨。暴露后，可用剪刀尖端刺穿颅骨，并向前剪开。必须格外小心，避免损伤小脑，以便于后续识别和去除软脑膜。剪开后，可用镊子将颅骨剥离，暴露脑组织，再用镊子或刮匙将其轻轻移入冰冷的解剖液中。为完整取出脑组织，可能需要切断视神经。（B）脑组织从颅骨中取出后，应使用尖头镊子从小脑表面去除软脑膜。（C

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
qPCR 慢病毒滴定试剂盒	ABM	#LV900
快速病毒纯化溶液	ABM	#LV999
pCMV-dR8.2	Addgene	#8455
pCMV-VS.VG	Addgene	#8454
蒸馏水	Gibco	#15230162
200 mM L-谷氨酰胺	Gibco	#25030081
35 mm Nunc 培养皿	Gibco	#174913
PowerUP SYBR Green 主混合液	life technologies	#A25742
BSA V 溶液	Sigma Aldrich	#A-8412
CaCl₂ • 2H₂O	Sigma Aldrich	#C-7902
喜树碱	Sigma Aldrich	#C-9911
鸡蛋清胰蛋白酶抑制剂	Sigma Aldrich	#10109878001
胞嘧啶 β-D-阿拉伯呋喃糖苷	Sigma Aldrich	#C-1768
D-(+)-葡萄糖	Sigma Aldrich	#G-7528
DNase1	Sigma Aldrich	#11284932001
伊格尔最低必需培养基	Sigma Aldrich	#M-2279
甘氨酸	Sigma Aldrich	#G-5417
热灭活透析胎牛血清	Sigma Aldrich	#F-0392
HEPES 缓冲液	Sigma Aldrich	#H-0887
过氧化氢	Sigma Aldrich	#216763
50 mg/mL 庆大霉素	Sigma Aldrich	#G-1397
MgSO₄	Sigma Aldrich	#M-2643
N-甲基-D-天冬氨酸	Sigma Aldrich	#M-3262
酚红溶液	Sigma Aldrich	#P-0290
胰蛋白酶	Sigma Aldrich	#T-4549
Lipofectamine 3000	Thermo Fisher Scientific	L3000-008
p3000 增强试剂	Thermo Fisher Scientific	L3000-008
Opti-MEM I 低血清培养基	Thermo Fisher Scientific	31985070
KCl	VWR	#CABDH9258
NaCl	VWR	#CABDH9286
NaH₂PO₄·H₂O	VWR	#CABDH9298
多聚 D-赖氨酸	VWR	#89134-858
DMEM	Wisent	#319-005-CL
FBS	Wisent	#080-450