建立小鼠原代小脑颗粒神经元损伤模型

摘要

来源：Laaper, M. 等., 在小鼠原代小脑颗粒神经元中建模神经元死亡与变性。J. Vis. Exp. (2017)。

本视频演示了在小鼠原代小脑颗粒神经元中建立神经元损伤模型的方法。该方法概述了使用NMDA（一种兴奋性神经递质受体激动剂）和甘氨酸（一种共激动剂）诱导神经元损伤的步骤。NMDA和甘氨酸结合于特定的神经元受体，导致受体过度激活，从而引起大量细胞内钙离子内流，最终导致神经元损伤和死亡。

方案

1. 实验准备

注意：以下贮存液可预先配制并保存至使用。

1. 灌流液
   1. 溶解 3.62 g 氯化钠（NaCl）、0.2 g 氯化钾（KCl）、0.069 g 磷酸钠（NaH₂PO₄ ∙ H₂O)，以及500 mL蒸馏水中溶解1.306 g D-(+)-葡萄糖₂然后，向溶液中加入12.5 mL HEPES缓冲液、450 µL 酚红溶液和20 mL 牛血清白蛋白（BSA）V组分。用1 N氢氧化钠（NaOH）调节pH至7.4。
   2. 用 0.22 µm 滤器过滤除菌，4 °C 保存。该溶液可稳定保存 1 周至 10 天。
2. 胰蛋白酶
   1. 配制浓度为 25 g/L 的胰蛋白酶溶液，溶剂为 0.9% 氯化钠。将溶液储存于 -20 °C。
3. 胰蛋白酶抑制剂
   1. 通过将1 g鸡卵清胰蛋白酶抑制剂溶解于100 mL 1 mM HCl中，配制浓度为10 mg/mL的储备液。将该溶液储存于-20 °C。

结果

图1：小鼠脑组织的取出及小脑解剖。（A）为提取6-7日龄小鼠的脑组织，使用一对镊子夹住头部，沿虚线用显微解剖剪在前方剪开皮肤。注意仅剪开皮肤和结缔组织，切口过深可能刺破颅骨并损伤脑组织。这三条切口——沿中线的一条直线切口和两条向外弯曲的切口——可使皮肤向后推开，暴露出颅骨。暴露后，可用剪刀尖端刺穿颅骨，并向前剪开。必须格外小心，避免损伤小脑，以便于后续识别和去除软脑膜。剪开后，可用镊子将颅骨剥离，暴露脑组织，再用镊子或刮匙将其轻轻移入冰冷的解剖液中。为完整取出脑组织，可能需要切断视神经。（B）脑组织从颅骨中取出后，应使用尖头镊子从小脑表面去除软脑膜。（C

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
qPCR 慢病毒滴定试剂盒	ABM	#LV900
快速病毒纯化溶液	ABM	#LV999
pCMV-dR8.2	Addgene	#8455
pCMV-VS.VG	Addgene	#8454
蒸馏水	Gibco	#15230162
200 mM L-谷氨酰胺	Gibco	#25030081
35 mm Nunc 培养皿	Gibco	#174913
PowerUP SYBR Green 主混合液	life technologies	#A25742
BSA V 溶液	Sigma Aldrich	#A-8412
CaCl₂ • 2H₂O	Sigma Aldrich	#C-7902
喜树碱	Sigma Aldrich	#C-9911
鸡蛋清胰蛋白酶抑制剂	Sigma Aldrich	#10109878001
胞嘧啶 β-D-阿拉伯呋喃糖苷	Sigma Aldrich	#C-1768
D-(+)-葡萄糖	Sigma Aldrich	#G-7528
DNase1	Sigma Aldrich	#11284932001
伊格尔最低必需培养基	Sigma Aldrich	#M-2279
甘氨酸	Sigma Aldrich	#G-5417
热灭活透析胎牛血清	Sigma Aldrich	#F-0392
HEPES 缓冲液	Sigma Aldrich	#H-0887
过氧化氢	Sigma Aldrich	#216763
50 mg/mL 庆大霉素	Sigma Aldrich	#G-1397
MgSO₄	Sigma Aldrich	#M-2643
N-甲基-D-天冬氨酸	Sigma Aldrich	#M-3262
酚红溶液	Sigma Aldrich	#P-0290
胰蛋白酶	Sigma Aldrich	#T-4549
Lipofectamine 3000	Thermo Fisher Scientific	L3000-008
p3000 增强试剂	Thermo Fisher Scientific	L3000-008
Opti-MEM I 低血清培养基	Thermo Fisher Scientific	31985070
KCl	VWR	#CABDH9258
NaCl	VWR	#CABDH9286
NaH₂PO₄·H₂O	VWR	#CABDH9298
多聚 D-赖氨酸	VWR	#89134-858
DMEM	Wisent	#319-005-CL
FBS	Wisent	#080-450