一种通过高渗盐水注射诱导大鼠青光眼的技术

摘要

来源：Gossman, C. A. 等. 在活体大鼠模型中诱导青光眼的实验方法及视网膜全层铺片制备. J. Vis. Exp. (2016)

本视频演示了通过向麻醉大鼠的巩膜上静脉注射高渗盐水以诱导青光眼的过程。盐水进入小梁网 通过 施莱姆管，导致组织瘢痕化，阻碍房水外流并升高眼内压。眼压升高会损伤视网膜神经节细胞，进而引发青光眼。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 动物

1. 本研究使用3月龄的雄性和雌性大鼠。
2. 将动物饲养在12小时光照/12小时黑暗循环环境中，自由摄食和饮水。

2. 动物麻醉用KAX（氯胺酮 + 赛拉嗪 + 乙酰丙嗪）混合制剂的制备

1. 将50 mg 塞拉嗪（20 mg/ml）溶于5 ml 氯胺酮（100 mg/ml）中，加入1 ml 乙酰丙嗪（10 mg/ml）和3 ml 蒸馏水，充分混匀。
2. 使用注射器滤器灭菌，并将此溶液储存于10 ml 血清瓶中。

3. KAX 注射

1. 称重动物（g），然后放回笼中，直至准备注射。
2. 使用1 ml胰岛素注射器配28 G针头，按0.1 ml KAX/100 g动物体重的剂量进行腹腔注射。
3. 使动物进入无意识状态。通过捏脚和尾部检查反射反应。
4. 手术期间，始终将所有动物安全地留在实验室内。
5. 手术后，将动物放回笼中，并在室温（RT）下保持舒适，直至恢复意识。只有当动物苏醒并恢复至正常行为后，方可将其送回动物饲养设施。

4. 手术准备与微针组装

1. 制备无菌的 2 M NaCl 溶液。
2. 使用微电极拉制仪（图 1C）将一根内径为 0.86 mm 的重抛光标准薄壁硼硅酸盐玻璃管拉制成两根精细锥形玻璃微针（图 1D、图 1E）。
3. 用回填注射针头和 1 ml 注射器将上一步制得的一根微针从后端填充 2 M 生理盐水（图 1B）。轻敲电极尖端以排出气泡。
4. 用 2 M NaCl 溶液填充第二个 1 ml 注射器，连接一根 18 G 针头，再接一段聚乙烯管（长约 10 英寸）（图 1A）。推动注射器活塞，使生理盐水通过针头充满聚乙烯管。
5. 当微针和聚乙烯管均充满生理盐水后，小心地将两者连接，并排除连接处的任何空气（图 2）。
6. 通过将微针尖端轻轻刮擦粗糙的纸巾表面，对其进行精细斜面打磨。
7. 轻轻推动注射器活塞，使液体在纸巾上形成细流，以此检测微针的电阻。液流宽度不应超过 0.5 mm。

5. 动物准备

1. 在角膜上滴入1-2滴局部麻醉剂（盐酸丙帕他卡因滴眼液，USP，0.5%），等待直至无眼球反射出现。
2. 用剪刀修剪胡须。
3. 用棉签蘸取聚维酮碘溶液，擦拭实验眼周围区域。
4. 在显微镜下，使用止血钳夹住下眼睑，使眼球突出，暴露巩膜上静脉并限制眼球运动。（图3，箭头）

6. 诱导青光眼的生理盐水注射

1. 当微针装置和动物准备就绪后，开始注射。
2. 当确认动物对足部/尾部夹捏无反应时，以与巩膜静脉呈10至20度的低角度小心刺入微针（图3，白色箭头）。当血液进入微针尖端时，表明静脉穿刺成功（图3，黑色箭头）。
3. 手动缓慢地将约50 µl生理盐水注入静脉，整个过程约持续10秒。随着盐溶液在血管系统中循环，静脉将变为苍白（图4，箭头）。部分区域可能仍保持血红色外观（图4，箭头）。
   1. 在与第一次注射位置相对的另一侧静脉部位进行第二次注射，以确保对整个视网膜神经节细胞层造成充分损伤。
      注意：数分钟内，随着盐溶液在血管系统中循环，应可通过瞳孔观察到明显浑浊的外观。
4. 保留对侧眼不做处理，作为内部对照。

结果

图1. 微针组件。（A） 带有聚乙烯管的注射器，用于生理盐水注射。（B） 用于反向填充硼硅酸盐微针的后充注射器。（C） Narishige电极拉制仪，用于制备硼硅酸盐微针。（D） 硼硅酸盐玻璃电极在拉制前和拉制后的状态。（E） 拉制后微电极针尖的放大视图。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
盐酸赛拉嗪，最低纯度 99%	Sigma, Life Science	X1251-1G
盐酸氯胺酮注射液，USP，100 mg/ml	Putney, Inc	NDC 26637-411-01	10 ml 瓶
马来酸乙酰丙嗪，10 mg/ml	Phoenix Pharmaceutical, Inc	NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408	50 ml 瓶
血清瓶，10 ml	VWR	16171319	硼硅酸盐玻璃
1 ml 胰岛素注射器	VWR	BD329410	28 G 针头
氯化钠	Sigma	S7653	2 M 溶液
微电极拉制仪	Narishige Group	PP-830
重型抛光标准薄壁硼硅酸盐毛细管	Sutter Instruments	B150-86-10HP	无丝，0.86 mm
用于填充微移液管的 Microfil 注射器针头	World Precision Instruments, Inc	MF28G
18 号鲁尔锁针头	Fisher Scientific	1130421	注射器针头
柔性聚乙烯管	Fisher Scientific	22046941	直径 0.034 英寸，约 10 英寸
盐酸丙帕他卡因眼用溶液，USP，0.5%	Akorn, Inc	NDC 17478-263-12	15 ml 无菌瓶
显微镜	Leica	StereoZoom 4
止血钳	Fine Science Tools	1310912	弯曲边缘
三重抗生素软膏	Fisher Scientific	NC0664481
手术刀柄	Fine Science Tools	10004-13
手术刀片 #11	Fine Science Tools	10011-00
60 mm × 15 mm 一次性培养皿	VWR	351007
磷酸盐缓冲液 10x 浓缩液	Sigma, Life Science	P7059-1L	1x 稀释
弹簧剪刀	Fine Science Tools	15009-08
镊子（2 把），Dumont #5	Fine Science Tools	11251-30
Sylgard 184	VWR	102092-312