从脑组织提取物中分离淀粉样纤维

摘要

来源：Upadhyay, A. 等，脑内淀粉样纤维核心的生化纯化与蛋白质组学表征。J. Vis. Exp. (2022)

本视频演示了使用密度梯度离心法和非淀粉样蛋白消化法从小鼠脑组织提取物中分离淀粉样纤维的实验方案。

方案

所有涉及动物样本的实验程序均已通过相应的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 组织采集与淀粉样蛋白纯化

注意：理想情况下，淀粉样纤维应从新鲜解剖的脑区中分离。然而，该方法也可适用于快速冷冻或闪冻的脑组织。以下是脑组织快速冷冻以供后续使用的简要操作流程。

1. 脑组织的采集与保存：解剖小鼠大脑，迅速分离富含淀粉样蛋白的区域（即皮层和海马），随后在液氮或干冰酒精浴中快速冷冻。
   注意：快速冷冻有助于保持组织成分的结构特性。小鼠通过异氟烷麻醉并行颈椎脱位处死。建议避免使用 CO₂，因其可能破坏脑组织蛋白质组的完整性。
2. 解剖后，将新鲜组织切成小块（例如 5 mm × 5 mm）并储存，以便在淀粉样蛋白提取前实现更高效的匀浆化。将组织转移至无菌冻存管中，拧紧管盖，并迅速浸入冷冻介质中。
3. 将组织保存在超低温条件下（即 -80 °C 或液氮中）。若计划在数日后进行提取，可将组织暂存于 -20 °C，避免反复冻融。提取和纯化前，将冷冻组织置于湿冰上解冻。
   ​注意：组织直接接触液氮可能导致组织和蛋白质损伤。需注意酒精浴可能清除管壁标签上的永久性标记笔字迹。

2. 十二烷基硫酸钠（SDS）不溶性物质的富集

注意：除非另有说明，所有步骤均需在冰上操作，并在 4 °C 下离心。化学品和仪器的生产厂家及目录编号见材料表。

1. 取新鲜解剖的或速冻后置于冰上解冻的脑组织区域，放入含有6-8个陶瓷珠和新配制的冰上预冷匀浆缓冲液（每0.25-1 g湿组织质量使用1 mL）的2 mL离心管中。
2. 将离心管转移至珠磨匀浆仪中，在4000 rpm条件下进行组织研磨，每次30秒，共两个循环，中间间隔30秒。
   注意：也可使用电动搅拌器或匀浆系统对组织进行研磨和匀浆。
3. 在15 mL离心管中，向1 mL全脑组织匀浆液中加入9 mL冰上预冷的匀浆缓冲液，用实验室封口膜密封，于4 °C下旋转过夜（端对端旋转），以确保充分溶解。
   注意：为去除不需要的大块细胞碎片和脂质，次日早晨在4 °C下以800 × g离心10分钟，收集上清液至新离心管中。将剩余沉淀用2 mL冰上预冷的匀浆缓冲液重悬，充分混匀后再次在4 °C下离心10分钟，并将两次获得的上清液合并。
4. 缓慢向组织提取物悬液中加入固体蔗糖，使其终浓度达到1.2 M，充分混匀后在4 °C下以250,000 × g离心45分钟。
5. 小心用移液器吸除并弃去上清液。通过吹打将沉淀重悬于含1.9 M蔗糖的2 mL匀浆缓冲液中，随后在4 °C下以125,000 × g离心45分钟。
   注意：缓冲液体积可根据前一步骤回收的材料量进行调整。通常，此步骤中匀浆缓冲液的最佳体积为样品体积的10倍（V/V）。
6. 用移液器小心收集顶部白色固体层，转移至新的离心管中，并通过反复吹打将其溶解于1 mL冰上预冷的洗涤缓冲液中，避免引入气泡。
7. 除顶层外，沉淀中也富含淀粉样纤维。为提高得率，可将这两部分合并后继续操作。小心用移液器移除中间的水相层并弃去。
8. 将合并后的组分在4 °C下以8000 × g离心20分钟，弃去上清液。
9. 向洗涤后的沉淀中加入1 mL冰上预冷的消化缓冲液，重悬后在室温（RT）孵育3小时。
10. 在4 °C下以8000 × g离心20分钟，用移液器移除上清液。
11. 将消化后的沉淀用1 mL冰上预冷的Tris缓冲液重悬并洗涤两次（操作同步骤2.8）。
12. 用移液器反复吹打，将洗涤后的沉淀重悬于含1% SDS和1.3 M蔗糖的1 mL溶解缓冲液中，随后在4 °C下快速以200,000 × g离心60分钟。
    注意：尽管淀粉样纤维对去垢剂和变性剂具有高度抗性，但长时间暴露于去垢剂（1% SDS）可能会影响纤维的完整性或去除紧密结合的蛋白质，从而影响后续分析。因此，在重悬沉淀后应立即进行离心操作。
13. 保留沉淀，并向剩余上清液中加入50 mM Tris缓冲液（体积比1:0.3），以将蔗糖浓度从1.3 M降低至1 M，然后在4 °C下再次以200,000 × g离心45分钟。
14. 将两次获得的沉淀溶解于含0.5% SDS的100 µL Tris缓冲液中，合并用于淀粉样蛋白纯化。可见的沉淀量较少，呈不透明状、微白色（见图1A）。

结果

图 1：利用生化染色和淀粉样纤维成像验证淀粉样蛋白的提取。（A）富含淀粉样蛋白的SDS不溶性沉淀呈不透明的灰白色。（B）将SDS可溶性上清液和含纯化淀粉样蛋白的SDS不溶性沉淀点样于0.45 µm硝酸纤维素膜，进行刚果红染色；BCA检测用于蛋白质上样量的归一化。BCA实验按照制造商说明书操作。（C）刚果红染色后SDS可溶性组分与淀粉样物质的明场显微图像（比例尺：100 µm）。（D）通过电子显微镜负染法观察SDS可溶性组分和纯化的淀粉样纤维（比例尺：100 nm）。（E）使...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
蛋白酶抑制剂	Thermo Scientific	164535	可使用其他厂家的替代仪器、化学品和抗体
氯化钙	Sigma-Aldrich	C1016	可使用其他厂家的替代仪器、化学品和抗体
胶原酶	Sigma-Aldrich	C0130	可使用其他厂家的替代仪器、化学品和抗体
完全蛋白酶抑制剂混合物	Sigma-Aldrich	11697498001	可使用其他厂家的替代仪器、化学品和抗体
脱氧核糖核酸酶 I（DNase I）	Thermo Fisher Scientific	EN0521	可使用其他厂家的替代仪器、化学品和抗体
K54 组织匀浆系统电机	Cole Parmer	Glas-Col 099C	可使用其他厂家的替代仪器、化学品和抗体
Optima L-90K 超速离心机	Beckman Coulter	BR-8101P-E	可使用其他厂家的替代仪器、化学品和抗体
Precellys 24 组织匀浆器	Bertin Instruments	P000062-PEVO0-A	可使用其他厂家的替代仪器、化学品和抗体
十二烷基硫酸钠（SDS）	Sigma-Aldrich	74255	可使用其他厂家的替代仪器、化学品和抗体
Sorvall Legend Micro 21R 微型离心机	Thermo Fisher Scientific	75002446	可使用其他厂家的替代仪器、化学品和抗体
Tris-HCl	Thermo Fisher Scientific	15568025	可使用其他厂家的替代仪器、化学品和抗体