评估神经元对脑室周围内皮细胞的化学吸引力线索的反应

摘要

来源:Datta， D. 等人。 人干细胞衍生的内皮细胞和 GABA 能神经元的迁移、化学吸引和共培养测定。J. Vis. Exp.（2020 年）。

该视频展示了一种测试响应脑室周围内皮细胞 （PVEC） 的化疗诱惑线索的中间神经元迁移的方法。中间神经元放置在中央隔室中，PVEC 和对照细胞位于两侧。向 PVEC 迁移的增加表明对其化学吸引力信号的积极反应。

方案

1. 化学吸引力测定

1. 使用无菌镊子将三孔培养插入物放在聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白包被的 35 mm 培养皿的中心。
将
2. 盘子倒置。使用带有超细尖端的永久性黑色记号笔标记嵌室中间隔室周围的边界。
3. 在 70 μL 神经元培养基的中间隔室中接种 3 x 10⁴ 个人 GABA 能中间神经元（图 1A）。
4. 在两个外隔室的 70 μL 脑室周围细胞培养基中接种 10⁴ 个人脑室周围内皮细胞，在 70 μL 对照内皮细胞培养基中接种 10⁴ 个对照内皮细胞（图 1A）。
5. 沿培养皿侧面添加 1 mL 共培养培养基（50% 不含 GABA 的脑室周围维持培养基和 50% 神经元培养基），以防止培养皿上的涂层干燥。
6. 在显微镜下检查，验证细胞没有从插入室中泄漏。
7. 将细胞在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育 24 小时。孵育 24 小时后，在显微镜下检查以验证细胞是否已正确附着并且没有泄漏。
8. 接种 48 小时后，使用无菌镊子轻轻取出插入片段。在显微镜下检查以验证细胞层是否不受干扰（第 0 天）。
9. 去除培养基并加入 1 mL 新鲜的共培养基。
   注意:为第 0 天的图像留出所需数量的菜肴。
10. 将细胞在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育 36 小时。36 小时后，吸出培养基，用 4% PFA 固定细胞 10 分钟，然后用 1x PBS 洗涤 3 次。
11. 用抗人 β-微管蛋白或抗人 MAP2 抗体对人 GABA 能中间神经元进行染色。在染色程序结束时，向每个培养皿中加入 1 mL 抗淬灭封固剂。

2. 成像和数据分析

1. 将免疫染色的检测皿置于显微镜下，放大 4 倍。
2. 在视野中保留矩形边界的一条长边（在上面的步骤 5.10 中制作）。拍摄与该边界相邻的无像元空间中的像元图像。沿矩形边界的右长边和左长边采集图像。
   注意:由于在选择短边或长边作为起始标记时存在歧义，因此不考虑相对于矩形沿对角线定位的单元格。此外，跨短边迁移的细胞数量通常明显较少（可能是由于沿短边的起始细胞数量较少），因此不予考虑。
3. 在 ImageJ 中打开图像。使用 ImageJ 计算每个单元格与边界标记之间的距离。
4. 要根据细胞数量评估迁移，请在 ImageJ 中为采集的图像中设置距边界的特定距离。计算此距离内存在的像元数。计算平均值，标准 devia
5. tion 和统计显着性使用适当的软件。

结果

图 1:化学吸引力测定。（A） 化疗吸引测定的方案。使用三孔培养插入片段，中间神经元 （IN） 接种在中间（绿色虚线矩形），而脑室周围内皮细胞（PV EC;橙色虚线矩形）和对照内皮细胞（EC;黄色虚线矩形）接种在两侧。（B） β-微管蛋白标记的中间神经元的图像显示向脑室周围内皮细胞的强烈迁移，但不向对照内皮细胞迁移。（C） 中间神经元化疗吸引力反应的定量。向脑室周围内皮细胞迁移的神经元数量显著高于对照内皮细胞。数据表示 ± S.D 的平均值（n = 5;*p < 0.05，学生 t 检验）。比例尺 = 100 μm。

材料