评估中间神经元对脑室周围内皮细胞化学吸引信号的反应

摘要

来源：Datta, D.，等。人干细胞来源的内皮细胞与GABA能神经元的迁移、化学趋化及共培养实验。J. Vis. Exp. (2020)。

本视频展示了一种检测中间神经元在脑室周围内皮细胞（PVECs）趋化信号作用下迁移能力的方法。将中间神经元置于中央区域，PVECs和对照细胞分别置于两侧。若中间神经元向PVECs侧迁移增加，则表明其对PVECs释放的趋化信号呈阳性反应。

方案

1. 化学趋化实验

1. 使用无菌镊子将一个三孔细胞培养插件放置在已包被多聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白的35 mm培养皿中央。
2. 将培养皿倒置，使用超细尖的永久性黑色记号笔在插件中间孔室周围标记边界。
3. 在中间孔室中加入3 × 10⁴个人类GABA能中间神经元，悬浮于70 µL神经元培养基中（图1A）。
4. 在两个外侧孔室中分别加入10⁴个人类室管膜周围内皮细胞于70 µL室管膜周围内皮细胞培养基中，以及10⁴个对照内皮细胞于70 µL对照内皮细胞培养基中（图1A）。
5. 沿培养皿壁加入1 mL共培养培养基（50%不含GABA的室管膜周围维持培养基和50%神经元培养基），以防止培养皿表面包被物干燥。
6. 在显微镜下检查，确认细胞未从插件孔室中泄漏。
7. 将细胞在37 °C、5% CO₂条件下孵育24小时。孵育24小时后，在显微镜下检查，确认细胞已正常贴壁且无泄漏现象。
8. 接种48小时后，使用无菌镊子轻轻移除插件。在显微镜下检查，确认细胞层未受扰动（第0天）。
9. 移除培养基，并加入1 mL新鲜共培养培养基。
   注意：预留一定数量的培养皿用于第0天的成像。
10. 将细胞在37 °C、5% CO₂条件下继续孵育36小时。36小时后，吸除培养基，用4%多聚甲醛固定细胞10分钟，并用1× PBS洗涤3次。
11. 使用抗人β-微管蛋白抗体或抗人MAP2抗体对人类GABA能中间神经元进行染色。染色步骤结束后，向每个培养皿中加入1 mL抗荧光淬灭封片剂。

2. 成像与数据分析

1. 将免疫染色后的检测皿置于显微镜下，使用 4X 放大倍数观察。
2. 使矩形边界的一个长边（如上述步骤 5.10 所绘制）保持在视野范围内。采集该边界相邻无细胞区域中的细胞图像。沿矩形边界的右侧长边和左侧长边分别采集图像。
   注意：由于难以明确选择短边或长边作为起始标记，位于矩形对角方向的细胞不予考虑。此外，跨越短边迁移的细胞数量通常显著较少（可能由于短边起始的细胞数量较少），因此也不予考虑。
3. 在 ImageJ 中打开图像。使用 ImageJ 计算每个细胞与边界标记之间的距离。
4. 若以细胞数量评估迁移情况，可在 ImageJ 中设定图像中距边界的一个特定距离范围。统计位于该距离范围内的细胞数量。使用适当的软件计算平均值、标准差
5. 以及统计学显著性。

结果

图1：化学趋化吸引实验。（A）化学趋化吸引实验示意图。使用三孔培养插件，将中间孔接种中间神经元（IN）（绿色虚线框），两侧孔分别接种脑室周围内皮细胞（PV ECs；橙色虚线框）和对照内皮细胞（ECs；黄色虚线框）。（B）β-微管蛋白标记的中间神经元图像，显示其向脑室周围内皮细胞方向发生显著迁移，而对照内皮细胞方向无明显迁移。（C）中间神经元化学趋化反应的定量分析。向脑室周围内皮细胞迁移的神经元数量显著高于向对照内皮细胞迁移的数量。数据表示为均值 ± 标准差（n = 5；*p < 0.05，Student t检验）。比例尺 = 100 µm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
对照人内皮细胞	Cellular Dynamics	R1022
对照内皮细胞培养基添加剂	Cellular Dynamics	M1019
DMEMF/12 培养基	Thermofisher Scientific	11320033
E6 培养基	Thermofisher Scientific	A1516401
FGF2	Thermofisher Scientific	PHG0261
纤连蛋白	Thermofisher Scientific	33016-015
GABA	Sigma-Aldrich	A2129
血细胞计数板	Sigma-Aldrich	Z359629
人GABA能神经元	Cellular Dynamics	R1013
人GABA能神经元基础培养基	Cellular Dynamics	M1010
人GABA能神经元神经添加剂	Cellular Dynamics	M1032
层粘连蛋白	Sigma	L2020
封片剂	Vector laboratories	H-1200
多聚-L-鸟氨酸	Sigma	p4957
PBS	Thermofisher Scientific	14190
VEGF-A	Peprotech	100-20
VascuLife VEGF 完全培养基试剂盒	Lifeline Cell Technologies	LL-0003	对照人内皮细胞培养基的组分
3孔硅胶细胞培养插件	ibidi	80369
35 mm 培养皿	Corning	430165
4% PFA 溶液	Fisher Scientific	AAJ19943K2
倒置相差显微镜	Zeiss	Zeiss Axiovert 40C
荧光显微镜	Olympus	FSX-100
抗人 β-微管蛋白抗体	Biolegend	802001
抗 MAP2 抗体	Neuromics	CH22103