从运动神经元裂解液中免疫沉淀目标蛋白质-DNA复合物

摘要

来源：Montanera, K. N. 等，Rhee, H. S. 利用染色质免疫沉淀-外切酶法（ChIP-Exo）在小鼠干细胞来源的神经元中实现蛋白质-DNA 相互作用的高分辨率定位。J. Vis. Exp. (2020)

本视频展示了利用靶蛋白特异性抗体包被的磁珠，从干细胞来源的运动神经元裂解液中免疫沉淀与靶蛋白交联的DNA片段。

方案

注意：建议使用经高压灭菌的蒸馏去离子水（ddH₂O）配制缓冲液和反应体系主混合液。

1. 细胞的收获与交联

1. 将小鼠胚胎干细胞（ES细胞）分化为有丝分裂后神经元后，向收获的细胞中加入11%的甲醛，使终浓度达到1%（v/v）。在室温（RT，25 °C）下，于摇床（摇板、摇床或旋转器）上振荡孵育细胞15分钟。
   注意：根据目标蛋白交联的需求，可采用较低浓度的甲醛交联（例如终浓度为0.5%），或使用二琥珀酰亚胺基己二酸酯（DSG）进行双重交联。
2. 加入2.5 M甘氨酸，使终浓度达到150 mM，以终止交联反应。在室温下，于摇床上振荡孵育5分钟。
3. 将交联后的细胞在15 mL圆锥形离心管中，于室温下以1,350 × g 离心6分钟。吸除上清液，然后将细胞重悬于5 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）中。
   注意：交联后的细胞沉淀可在液氮中快速冷冻后，于-80 °C保存。

2. 细胞裂解

注意：本方案中的以下步骤适用于约 2 × 10⁷

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖，UltraPure	Invitrogen	16500	检测超声处理（第4.3.6节）
牛血清白蛋白（BSA），无蛋白酶，用于热激分离，纯度≥98%	BioShop	ALB003	封闭溶液
抗 Isl1 抗体	DSHB	39.3F7	抗体与磁珠孵育（第5.6节）
Bioruptor Pico	Diagenode	B01060010	染色质超声处理（第3.3节）
Centrifuge 5424 R	Eppendorf	5404000138	染色质超声处理（第3.5节），检测超声处理（第4.3.1、4.3.3和4.3.4节）
Centrifuge 5804 R	Eppendorf	22623508	细胞收获、交联与冷冻（第1.3节），细胞裂解（第2.2和2.3节），染色质超声处理（第3.1节）
Complete，Mini，无EDTA蛋白酶抑制剂混合物	Roche	4693159001	添加至所有缓冲液中，蛋白酶K缓冲液和ChIP洗脱缓冲液除外
脱氧胆酸钠盐	fisher scientific	BP349	裂解缓冲液3、高盐洗涤缓冲液和LiCl洗涤缓冲液
EDTA，0.5 M，无菌溶液，pH 8.0	BioShop	EDT111	裂解缓冲液1-3、检测超声处理（第4.1节）、高盐洗涤缓冲液、LiCl洗涤缓冲液和ChIP洗脱缓冲液
无水乙醇，100%	Commercial alcohols	P006EAAN	检测超声处理（第4.3.3节）
甲醛，36.5–38%，含10–15%甲醇	Sigma	F8775	细胞收获、交联与冷冻（第1.1节）
甘油，试剂级，纯度≥99.5%	BioShop	GLY002	裂解缓冲液1
甘氨酸，生物技术级，纯度≥99%	BioShop	GLN001	细胞收获、交联与冷冻（第1.2节）
糖原，RNA级	Thermo Scientific	R0551	检测超声处理（第4.3.3节）
HEPES，1 M，无菌过滤溶液，pH 7.3	BioShop	HEP003	裂解缓冲液1、高盐洗涤缓冲液
氯化锂（LiCl），试剂级	Bioshop	LIT704	LiCl洗涤缓冲液
用于ChIP的磁珠（Dynabeads Protein G）	Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP)	Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP)	抗体与磁珠孵育（第5节）
磁力架（DynaMag-2 Magnet）	Invitrogen	12321D	用于第5节中的多个步骤
N-月桂酰肌氨酸钠盐溶液，30%水溶液，≥97.0%（HPLC）	Sigma	61747	裂解缓冲液3
辛基酚聚氧乙烯醚（IGEPAL CA630）	BioShop	NON999	裂解缓冲液1和LiCl洗涤缓冲液
苯酚:氯仿:异戊醇，生物技术级（25:24:1）	BioShop	PHE512	检测超声处理（第4.3.1节）
磷酸盐缓冲液（PBS），1x	Corning	21040CV	细胞收获、交联与冷冻（第1.3节）和染色质超声处理（第3.1节），抗体与磁珠孵育（第5.1节）
PowerPac Basic 电源供应器	BioRad	1645050	检测超声处理（第4.3.6节）
蛋白酶K溶液，RNA级	Invitrogen	25530049	检测超声处理（第4.2节）
RNase A，无DNase和蛋白酶	Thermo Scientific	EN0531	检测超声处理（第4.3.2节）
氯化钠（NaCl），BioReagent级	Sigma	S5886	裂解缓冲液1-3、高盐洗涤缓冲液
十二烷基硫酸钠（SDS），电泳级	BioShop	SDS001	检测超声处理（第4.1节）、高盐洗涤缓冲液和ChIP洗脱缓冲液
超声破碎珠和15 mL Bioruptor管	Diagenode	C01020031	染色质超声处理（第3.1和3.2节）
ThermoMixer F1.5	Eppendorf	5384000020	第4.2、4.3.2和4.3.5节
三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液（Tris-HCl），经BioPerformance认证，1 M，pH 7.4	Sigma	T2194	10 mM Tris-HCl缓冲液
三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液（Tris-HCl），经BioPerformance认证，1 M，pH 8.0	Sigma	T2694	裂解缓冲液2、裂解缓冲液3、检测超声处理（第4.1节）、LiCl洗涤缓冲液和ChIP洗脱缓冲液
VWR Mini 试管摇床，可调速	VWR	10159-752	用于第1、2、5、6和7节中的多个步骤
2-[4-(2,4,4-三甲基戊-2-基)苯氧基]乙醇，Triton X-100，试剂级	BioShop	TRX506	裂解缓冲液1、染色质超声处理（第3.4节）和高盐洗涤缓冲液