从运动神经元裂解液中免疫沉淀目标蛋白质-DNA复合物

摘要

来源：Montanera, K. N. 等，Rhee, H. S. 利用染色质免疫沉淀-外切酶法（ChIP-Exo）在小鼠干细胞来源的神经元中实现蛋白质-DNA 相互作用的高分辨率定位。J. Vis. Exp. (2020)

本视频展示了利用靶蛋白特异性抗体包被的磁珠，从干细胞来源的运动神经元裂解液中免疫沉淀与靶蛋白交联的DNA片段。

方案

注意：建议使用经高压灭菌的蒸馏去离子水（ddH₂O）配制缓冲液和反应体系主混合液。

1. 细胞的收获与交联

1. 将小鼠胚胎干细胞（ES细胞）分化为有丝分裂后神经元后，向收获的细胞中加入11%的甲醛，使终浓度达到1%（v/v）。在室温（RT，25 °C）下，于摇床（摇板、摇床或旋转器）上振荡孵育细胞15分钟。
   注意：根据目标蛋白交联的需求，可采用较低浓度的甲醛交联（例如终浓度为0.5%），或使用二琥珀酰亚胺基己二酸酯（DSG）进行双重交联。
2. 加入2.5 M甘氨酸，使终浓度达到150 mM，以终止交联反应。在室温下，于摇床上振荡孵育5分钟。
3. 将交联后的细胞在15 mL圆锥形离心管中，于室温下以1,350 × g 离心6分钟。吸除上清液，然后将细胞重悬于5 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）中。
   注意：交联后的细胞沉淀可在液氮中快速冷冻后，于-80 °C保存。

2. 细胞裂解

注意：本方案中的以下步骤适用于约 2 × 10⁷ 个由小鼠 ES 细胞分化而来的神经元细胞。为裂解细胞，将使用含有多种去垢剂的裂解缓冲液。使用前，向 50 mL 缓冲液中加入 50 µL 的 1000 倍浓缩蛋白酶抑制剂（CPI）储备液。

1. 按照表1所述配制裂解缓冲液1−3。
2. 将交联的细胞沉淀置于冰上解冻，然后在15 mL锥形管中用3 mL裂解缓冲液1充分重悬细胞沉淀。在摇床上4 °C振荡15分钟。在4 °C以1,350 x g离心5分钟，吸除上清液。
3. 用3 mL裂解缓冲液2充分重悬沉淀的细胞。在摇床上4 °C振荡10分钟。在4 °C以1,350 x g离心5分钟，吸除上清液。
4. 向每份沉淀中加入1 mL裂解缓冲液3，然后置于冰上。立即进行超声处理。

3. 超声破碎染色质

注意：在超声处理过程中，将样品置于冰上或 4 °C 环境中，以减少交联逆转。

1. 使用无菌刮勺，将珠磨珠（材料表）加入至15 mL聚苯乙烯管的0.2 mL刻度线处。用600 µL的1× PBS重悬磨珠，涡旋混匀直至无干斑可见。在30 × g 条件下离心5 s，吸除1× PBS。
   注意：在聚苯乙烯管中进行超声处理比在聚丙烯管中更高效。若细胞数量较少（例如，<10⁶ 个细胞），请使用1.5 mL聚苯乙烯管，并不添加磨珠。
2. 将核裂解物充分重悬于1 mL裂解缓冲液3（来自步骤2.4）中，然后转移至含有磨珠的15 mL聚苯乙烯管中。短暂涡旋混匀聚苯乙烯管。
3. 为片段化交联的染色质DNA，在4 °C下以优化的循环次数进行超声处理，超声功率设为30 W，循环程序设为开启30 s、关闭30 s。
   注意：针对每种细胞类型和批次优化超声条件，可获得最佳的染色质免疫沉淀-外切酶（ChIP-exo）产率。对于2 × 10⁷ 个小鼠神经元细胞，在上述条件下进行20–30个超声循环，可将染色质片段化至100–500 bp范围内。
4. 超声完成后，将每个样本的全部上清液（超声处理后的裂解物）转移至1.5 mL离心管中。向每个样本中加入10% 2-[4-(2,4,4-三甲基戊烷-2-基)苯氧基]乙醇，终浓度为1%。用移液器吹打混匀。
5. 为沉淀细胞碎片，在4 °C下以13,500 × g 离心10 min。将每个样本的全部超声裂解物（上清液）转移至新的1.5 mL离心管中。
6. 从每个样本中取30 µL超声裂解物（约占超声后裂解物的3%），加入新的1.5 mL离心管中用于检测超声效果。其余超声裂解物暂存于4 °C，待与抗体包被的磁珠孵育时使用。

4. 检查超声处理

1. 加入2 mL 0.5 M Tris-HCl（pH 8.0）、2 mL 0.5 M 乙二胺四乙酸（EDTA）、10 mL 10% 十二烷基硫酸钠（SDS）和6 mL 经高压灭菌的ddH₂O，配制成20 mL 2×蛋白酶K缓冲液。₂O. 不要向此缓冲液中添加CPI。在室温下储存于50 mL离心管中。
2. 为逆转蛋白质-DNA交联并去除蛋白质，从每个样本（步骤3.6）中取30 µL超声处理后的染色质，加入166 µL经高压灭菌的ddH₂O₂O, 200 µL 的 2x 蛋白酶 K 缓冲液和 4 µL 的 20 mg/mL 蛋白酶 K。短暂涡旋混匀样品，然后在 65 °C 下孵育 1−3 小时，24 x g.
3. 注意： 超声处理后的裂解液可在65 °C下逆转交联过夜。
4. 使用酚:氯仿:异戊醇（PCIA: 25:24:1）和乙醇沉淀法提取DNA，步骤如下。
   警告： PCIA 具有毒性，需在通风橱中使用，并佩戴标准个人防护装备（PPE）。
   1. 向1.5 mL离心管中的每个样品加入400 µL PCIA，将涡旋振荡器调至最高速度，振荡20 s。在18,400 x g 室温下静置6分钟，将观察到两个相。小心地将每个样品的上层水相（澄清相）转移至新的1.5 mL离心管中。
   2. 加入1 µL 10 mg/mL的RNase A。将样品在37 °C孵育30分钟。
   3. 向每个样本中加入1 µL 20 mg/mL的糖原，然后加入1 mL预冷的100%乙醇（存放于-20 °C冰箱中）进行沉淀。短暂混匀后，将样本置于-80 °C冰箱中孵育30分钟至1小时。在18,400 x g 4 °C 下孵育 10 分钟，小心倒出 100% 乙醇。
   4. 用500 µL预冷至-20 °C的70%乙醇洗涤沉淀。在18,400 x g 4 °C 下静置 5 分钟。小心倒出 70% 乙醇。
   5. 将样品置于1.5 mL离心管中，在50 °C下孵育，直至残留乙醇完全蒸发。用15 µL经高压灭菌的ddH2O或无核酸酶的ddH2O重悬DNA沉淀。
   6. 将提取的DNA样本与DNA分子量标准品一同在1.5%琼脂糖凝胶中以120−180 V电压电泳，检测超声处理后DNA的片段大小。

5. 抗体与磁珠孵育

注意：本方案中的以下步骤适用于约 2 × 10⁷ 个由小鼠胚胎干细胞分化而来的神经元细胞。在 ChIP-exo 操作过程中，切勿冻存和解冻磁珠，因为磁珠可能破裂，导致样本污染或抗体性能下降。

1. 细胞裂解和超声处理后，为染色质免疫沉淀（ChIP）准备Protein G磁珠（材料表），将磁珠充分混匀，然后向2 mL低吸附蛋白管中各加入25 µL磁珠。
   注意：所用磁珠的类型取决于抗体的物种来源。
2. 用1 mL封闭液（表1）洗涤磁珠，充分混匀后置于磁力架上1分钟。仍在磁力架上时，待上清澄清后将其弃去。
3. 向磁珠中加入1 mL封闭液，在4 °C摇床中轻轻振荡孵育10分钟。短暂离心后，将管子置于磁力架上并弃去上清液。
4. 重复步骤5.3两次。
5. 向磁珠中加入500 µL封闭液。短暂离心后，取抗Isl1抗体（0.04 µg/µL，材料表），向含有磁珠和封闭液的相应2 mL低吸附蛋白管中加入4 µg抗体。
6. 重复步骤5.5，但不加抗体（即ChIP实验的无抗体对照）。
   注意：抗体的添加量可根据抗体质量和用于ChIP的细胞数量通过实验经验确定。
7. 将样品在4 °C摇床中振荡孵育6−24小时。

6. 染色质免疫沉淀（ChIP）

1. 用1 mL封闭液洗涤第5.8步中的抗体包被磁珠。将样品置于4 °C摇床上孵育5 min，然后移除上清液。
2. 重复步骤6.1共两次。
3. 将抗体包被磁珠重悬于50 µL封闭液中，然后转移至新的2 mL低结合蛋白管。对于每个ChIP样品，将超声处理后的裂解液（约1.0 mL，来自第3.6步）加入2 mL低结合蛋白管中的抗体包被磁珠中。
4. 将每个样品在4 °C摇床上孵育过夜。

7. 染色质免疫沉淀洗涤步骤

注意：在 ChIP 洗涤过程中，需将样品置于冰上或 4 °C 以维持蛋白质-DNA 交联状态。

1. 按表2所述配制高盐洗涤缓冲液、LiCl洗涤缓冲液和10 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）。将缓冲液储存于50 mL离心管中，4 °C保存。使用前立即向所有缓冲液中加入50 µL的1000倍CPI储备液。
2. 将2 mL低吸附蛋白离心管中的样品短暂离心，以收集管盖内的液体，然后置于磁力架上1分钟，用移液器小心吸除上清液。
3. 进行ChIP洗涤时，向每管中加入1 mL裂解缓冲液3（4 °C预冷）。在4 °C摇床上混匀5分钟。短暂离心样品，置于磁力架上1分钟，用移液器吸除上清液。
4. 向每管中加入1 mL预冷的高盐洗涤缓冲液。在4 °C摇床上混匀5分钟。短暂离心样品，置于磁力架上1分钟，用移液器吸除上清液。
5. 向每管中加入1 mL预冷的LiCl洗涤缓冲液。在4 °C摇床上混匀5分钟。短暂离心样品，置于磁力架上1分钟，用移液器吸除上清液。
6. 向每管中加入1 mL预冷的10 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）。在4 °C摇床上混匀5分钟。短暂离心样品，置于磁力架上1分钟，用移液器吸除上清液。
   注意：可使用Tris-EDTA缓冲液（pH 8.0）替代Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）。

表1：裂解缓冲液1−3及封闭缓冲液的配方。置于50 mL离心管中，4 °C保存。使用前立即向所有缓冲液中各加入50 µL的1000倍浓度CPI（完全蛋白酶抑制剂）储备液。

裂解缓冲液 1
试剂	体积 (mL)	[终浓度]
1 M HEPES (pH 7.3)	2.5	50 mM
5 M NaCl	1.4	140 mM
0.5 M EDTA (pH 8.0)	0.1	1 mM
50% 甘油	10	10%
10% 辛基酚聚氧乙烯醚	2.5	0.50%
10% 2-[4-(2,4,4-三甲基戊烷-2-基)苯氧基]乙醇	1.25	0.25%
高压灭菌 ddH2O	加至 50
裂解缓冲液 2
试剂	体积 (mL)	[终浓度]
0.5 M Tris-HCl (pH 8.0)	1	10 mM
5 M NaCl	2	200 mM
0.5 M EDTA (pH 8.0)	0.1	1 mM
高压灭菌 ddH2O	加至 50
裂解缓冲液 3
试剂	体积 (mL)	[终浓度]
1 M Tris-HCl (pH 8.0)	0.5	10 mM
5 M NaCl	1	100 mM
0.5 M EDTA (pH 8.0)	0.1	1 mM
10% 脱氧胆酸	0.5	0.10%
30% 月桂酰肌氨酸钠溶液	0.83	0.50%
高压灭菌 ddH2O	加至 50
封闭液
试剂	用量	[终浓度]
牛血清白蛋白 (BSA)	250 mg	0.50%
完全蛋白酶抑制剂 (CPI, 1000x)	50 µL	1x
磷酸盐缓冲液 (PBS)	加至 50 mL

表2：ChIP洗涤液配方：高盐洗涤缓冲液、LiCl洗涤缓冲液和10 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）。置于4 °C下，储存在50 mL离心管中。使用前立即向所有缓冲液中加入50 µL的1000倍CPI储备液。

高盐洗涤缓冲液
试剂	体积 (mL)	[终浓度]
1 M HEPES (pH 7.3)	2.5	50 mM
5 M NaCl	5	500 mM
0.5 M EDTA (pH 8.0)	0.1	1 mM
10% 2-[4-(2,4,4-三甲基戊烷-2-基)苯氧基]乙醇	5	1%
5% 脱氧胆酸	1	0.10%
5% SDS	1	0.10%
高压灭菌 ddH2O	加至 50
LiCl 洗涤缓冲液
试剂	体积 (mL)	[终浓度]
0.5 M Tris-HCl (pH 8.0)	2	20 mM
0.5 M EDTA (pH 8.0)	0.1	1 mM
1 M LiCl	12.5	250 mM
10% 辛基酚聚氧乙烯醚	2.5	0.50%
5% 脱氧胆酸	5	0.50%
高压灭菌 ddH2O	加至 50
10 mM Tris-HCl 缓冲液
试剂	体积 (mL)	[终浓度]
1 M Tris-HCl (pH 7.4)	0.5	10 mM
高压灭菌 ddH2O	加至 50

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖，UltraPure	Invitrogen	16500	检测超声处理（第4.3.6节）
牛血清白蛋白（BSA），无蛋白酶，用于热激分离，纯度≥98%	BioShop	ALB003	封闭溶液
抗 Isl1 抗体	DSHB	39.3F7	抗体与磁珠孵育（第5.6节）
Bioruptor Pico	Diagenode	B01060010	染色质超声处理（第3.3节）
Centrifuge 5424 R	Eppendorf	5404000138	染色质超声处理（第3.5节），检测超声处理（第4.3.1、4.3.3和4.3.4节）
Centrifuge 5804 R	Eppendorf	22623508	细胞收获、交联与冷冻（第1.3节），细胞裂解（第2.2和2.3节），染色质超声处理（第3.1节）
Complete，Mini，无EDTA蛋白酶抑制剂混合物	Roche	4693159001	添加至所有缓冲液中，蛋白酶K缓冲液和ChIP洗脱缓冲液除外
脱氧胆酸钠盐	fisher scientific	BP349	裂解缓冲液3、高盐洗涤缓冲液和LiCl洗涤缓冲液
EDTA，0.5 M，无菌溶液，pH 8.0	BioShop	EDT111	裂解缓冲液1-3、检测超声处理（第4.1节）、高盐洗涤缓冲液、LiCl洗涤缓冲液和ChIP洗脱缓冲液
无水乙醇，100%	Commercial alcohols	P006EAAN	检测超声处理（第4.3.3节）
甲醛，36.5–38%，含10–15%甲醇	Sigma	F8775	细胞收获、交联与冷冻（第1.1节）
甘油，试剂级，纯度≥99.5%	BioShop	GLY002	裂解缓冲液1
甘氨酸，生物技术级，纯度≥99%	BioShop	GLN001	细胞收获、交联与冷冻（第1.2节）
糖原，RNA级	Thermo Scientific	R0551	检测超声处理（第4.3.3节）
HEPES，1 M，无菌过滤溶液，pH 7.3	BioShop	HEP003	裂解缓冲液1、高盐洗涤缓冲液
氯化锂（LiCl），试剂级	Bioshop	LIT704	LiCl洗涤缓冲液
用于ChIP的磁珠（Dynabeads Protein G）	Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP)	Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP)	抗体与磁珠孵育（第5节）
磁力架（DynaMag-2 Magnet）	Invitrogen	12321D	用于第5节中的多个步骤
N-月桂酰肌氨酸钠盐溶液，30%水溶液，≥97.0%（HPLC）	Sigma	61747	裂解缓冲液3
辛基酚聚氧乙烯醚（IGEPAL CA630）	BioShop	NON999	裂解缓冲液1和LiCl洗涤缓冲液
苯酚:氯仿:异戊醇，生物技术级（25:24:1）	BioShop	PHE512	检测超声处理（第4.3.1节）
磷酸盐缓冲液（PBS），1x	Corning	21040CV	细胞收获、交联与冷冻（第1.3节）和染色质超声处理（第3.1节），抗体与磁珠孵育（第5.1节）
PowerPac Basic 电源供应器	BioRad	1645050	检测超声处理（第4.3.6节）
蛋白酶K溶液，RNA级	Invitrogen	25530049	检测超声处理（第4.2节）
RNase A，无DNase和蛋白酶	Thermo Scientific	EN0531	检测超声处理（第4.3.2节）
氯化钠（NaCl），BioReagent级	Sigma	S5886	裂解缓冲液1-3、高盐洗涤缓冲液
十二烷基硫酸钠（SDS），电泳级	BioShop	SDS001	检测超声处理（第4.1节）、高盐洗涤缓冲液和ChIP洗脱缓冲液
超声破碎珠和15 mL Bioruptor管	Diagenode	C01020031	染色质超声处理（第3.1和3.2节）
ThermoMixer F1.5	Eppendorf	5384000020	第4.2、4.3.2和4.3.5节
三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液（Tris-HCl），经BioPerformance认证，1 M，pH 7.4	Sigma	T2194	10 mM Tris-HCl缓冲液
三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液（Tris-HCl），经BioPerformance认证，1 M，pH 8.0	Sigma	T2694	裂解缓冲液2、裂解缓冲液3、检测超声处理（第4.1节）、LiCl洗涤缓冲液和ChIP洗脱缓冲液
VWR Mini 试管摇床，可调速	VWR	10159-752	用于第1、2、5、6和7节中的多个步骤
2-[4-(2,4,4-三甲基戊-2-基)苯氧基]乙醇，Triton X-100，试剂级	BioShop	TRX506	裂解缓冲液1、染色质超声处理（第3.4节）和高盐洗涤缓冲液