小脑类器官切片的荧光免疫染色

摘要

来源：Silva, T. P.，等，由人多能干细胞可扩展地生成成熟的小脑类器官及其通过免疫染色的表征。视觉化实验杂志（2020）

本视频展示了小脑类器官切片的免疫荧光染色，用于鉴定在不同类型小脑神经元中表达的特定靶抗原，这些抗原可作为类器官成熟度的指标。

方案

1. 类器官切片的免疫染色

1. 将含有类器官切片的载玻片放入盛有 50 mL 预热 1× PBS 的染色缸中，最多可将 10 张载玻片背靠背放置。
   注意：所有类器官切片应浸没在液体中。
2. 在 37 °C 下孵育 45 分钟，以去除明胶。
3. 用 50 mL 1× PBS 在室温下洗涤一次，每次 5 分钟：将载玻片转移至含有新鲜 1× PBS 的染色缸中。
4. 将载玻片转移至含有 50 mL 新鲜配制的甘氨酸溶液（表 1）的染色缸中，在室温下孵育 10 分钟。
5. 将载玻片转移至含有 50 mL 0.1% 曲拉通（表 1）的染色缸中，在室温下透化处理 10 分钟。
6. 用 1× PBS 洗涤 2 次，每次 5 分钟。
7. 准备免疫染色皿，将浸有 1× PBS 的 3 mm 滤纸置于其中。用纸巾在切片周围将载玻片擦干，并将其放置在 3 mm 滤纸上。使用巴氏吸管，将封闭液（表 1）覆盖整个载玻片表面，每张载玻片加 0.5 mL。在室温下孵育 30 分钟。
8. 吸去多余的封闭液，并用纸巾在切片周围将载玻片擦干。将 50 µL 用封闭液稀释的一抗（表 2）加至切片上，盖上盖玻片。将载玻片放入预先准备好的免疫染色皿中。在 4 °C 下过夜孵育。
9. 再次将载玻片转移至含有 50 mL TBST（表 1）的染色缸中，让盖玻片自然脱落，并用 TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
10. 将 50 µL 用封闭液稀释的二抗加至切片上，盖上盖玻片。将载玻片放入预先准备好的免疫染色皿中。在室温下孵育 30 分钟，避光。
11. 再次将载玻片转移至染色缸中，用 50 mL TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
12. 用纸巾在切片周围将载玻片擦干，并将载玻片放入预先准备好的免疫染色皿中。使用巴氏吸管，将 0.5 mL DAPI 溶液均匀覆盖在载玻片整个表面。在室温下孵育 5 分钟。
13. 重复步骤 1.9。
14. 用纸巾小心擦干载玻片。沿载玻片逐滴加入 50 µL 封片剂，然后小心地将盖玻片缓缓放下，略微弯曲以避免产生气泡。

表1：用于制备类器官以进行冷冻切片和免疫染色的溶液。 列出了用于制备类器官进行冷冻切片和免疫染色所需溶液的所有组分及体积。

明胶/蔗糖 终浓度：7.5%/15% w/w	1. 在无菌肖特玻璃瓶中称取15 g蔗糖和7.5 g明胶，充分混合 2. 将1× PBS预热至65 °C 3. 加入预热的1×PBS至终质量为100 g，并充分混匀 4. 将Schott玻璃瓶置于65 °C的加热板上，振荡至明胶完全融化 5. 37 °C 下孵育至溶液稳定
甘氨酸 终浓度：0.1 M	向50 mL新配制的1× PBS中加入0.37 g甘氨酸。
Triton 溶液 终浓度：0.1 % w/v	1. 配制10 % Triton X-100储存液：将5 g Triton X-100溶于50 mL 1x PBS中 2. 将0.5 mL Triton X-100 储液加入50 mL 1x PBS中。
TBST 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.05 % w/v Tween-20	20 mL Tris 1 M 30 mL NaCl 5 M 5 mL 吐温-20（10% 储液：5 g 吐温-20 溶于 50 mL 水） 加水至 1 L。
封闭液	向 50 mL TBST 中加入 5 mL 胎牛血清（FBS，终浓度：10% v/v）。
DAPI 溶液	向10 mL蒸馏水中加入15 µL DAPI储存液（1 mg/mL）
Mowiol	1. 将2.4 g Mowiol加入6 g甘油中，在50 °C预热的平板中振荡1小时 2. 加入6 mL蒸馏水，振荡2 h 3. 加入12 mL 200 mM Tris（pH 8.5），振荡10分钟 4. 在5,000 × g下离心15分钟 5. 分装后于-20 °C保存

表2：一抗。 列出了用于免疫染色的一抗、克隆号及优化后的稀释比例。

抗体	宿主物种	稀释比例
BARHL1	rabbit	1/500
CALBINDIN	rabbit	1/500
MAP2	mouse	1/1000
N-CADHERIN	mouse	1/1000
NESTIN	mouse	1/400
OLIG2	rabbit	1/500
PAX6	rabbit	1/400
SOX2	mouse	1/200
TBR1	rabbit	1/200
TBR2	rabbit	1/200
TUJ1	mouse	1/1000

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3MM 滤纸	WHA3030861	Merck
抗 BARHL1 抗体	HPA004809	Atlas Antibodies
抗 Calbindin D-28k 抗体	CB28	Millipore
抗 MAP2 抗体	M4403	Sigma
抗 N-钙黏蛋白抗体	610921	BD Transduction
抗 NESTIN 抗体	MAB1259-SP	R&D
抗 OLIG2 抗体	MABN50	Millipore
抗 PAX6 抗体	PRB-278P	Covance
抗 SOX2 抗体	MAB2018	R&D
抗 TBR1 抗体	AB2261	Millipore
抗 TBR2 抗体	ab183991	Abcam
抗 TUJ1 抗体	801213	Biolegend
盖玻片 24×60 mm	631-1575	VWR
DAPI	10236276001	Sigma
胎牛血清	A3840001	ThermoFisher
牛皮明胶	G9391	Sigma
玻璃染色缸	E94	ThermoFisher
甘氨酸	MB014001	NZYtech
巯基甘油	M6154	Sigma
Mowiol	475904	Millipore	封片剂
Triton X-100	9002-93-1	Sigma
Tween-20	P1379	Sigma
SuperFrost 显微镜载玻片	12372098	ThermoFisher	黏附性显微镜载玻片