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1. 从iPSC/hESC二维培养物构建脑类器官（第0天）
注意：本方案假设干细胞（SC）的维持培养是在无异源成分的干细胞维持培养基（SCMM）中进行，并使用纤连蛋白或Geltrex基质。如果使用其他高蛋白干细胞培养基，建议在启动类器官形成前，先将干细胞培养物转换至SCMM中传代至少两次。本方案尚未在基于饲养层的干细胞培养方法中进行测试。
- 采用常规的干细胞（SC）培养方法，将细胞培养至50%–70%融合度。通常在传代后3–4天达到此状态，但具体时间可能因培养方法和细胞系而异。
注意：约需6孔板中的2个孔的细胞，才能生成一个完整的96孔板类器官。
- 使用明场显微镜在10X–20X放大倍数下检查培养物，确保细胞集落形态健康，无明显分化迹象。
- 将干细胞培养基（SCMM）置于37 °C水浴中预热，并将一支50 µL的50 mM Y-27632（ROCK抑制剂）和2 mL酶法解离试剂解冻至室温。
- 准备一个超低吸附U型底96孔板、多通道P200移液器和一个25 mL试剂储液槽。
- 在50 mL锥形管中分装45 mL SCMM，并加入45 µL 50 mM Y-27632。通过吹打充分混匀。
- 用真空抽吸法吸除含干细胞的两个孔中的培养基，然后使用P1000移液器迅速向每个孔加入1 mL无酶解离试剂。将培养板置于37 °C培养箱中孵育4分钟。
- 用真空抽吸法吸除处理后的孔中试剂，再使用P1000移液器向每个孔加入1 mL酶法解离试剂。
- 将培养板置于37 °C培养箱中继续孵育5分钟。
- 取出培养板并检查处理后的孔。轻轻敲击培养板以打散聚集的细胞。若仍可见较大细胞团块，则在37 °C下额外孵育2分钟。重复此步骤，直至肉眼不可见细胞团块。
- 待细胞充分解离后，向每个孔加入1 mL SCMM以终止解离酶作用。将4 mL细胞悬液合并至一个50 mL锥形管中，并取少量用于细胞计数。
- 将维持培养板中其余未处理的孔放回37 °C培养箱继续培养。
- 在细胞计数的同时，以300 × g离心细胞悬液5分钟。
- 确定细胞总数，并计算为获得60,000个细胞/mL的悬液所需添加的SCMM + Y-27632溶液的体积。
- 小心地用真空抽吸法吸除上清液，加入计算好的SCMM + Y-27632溶液体积。用5 mL移液器吹打混匀5–10次，确保细胞悬液均匀。
- 立即将细胞悬液转移至试剂储液槽中，使用多通道P200移液器向ULA U型底96孔板的每孔加入150 µL。此操作可生成96个独立的类器官，每个初始含9,000个细胞。
- 以150 × g离心培养板1分钟。
- 将培养板放入37 °C培养箱中，48小时内勿扰动。
2. 脑类器官的维持（第2天）
- 在50 mL锥形管中配制17 mL SCMM，并加入17 µL的50 mM Y-27632。将SCMM + Y-27632溶液置于37 °C水浴中预热。
- 从培养箱中取出类器官培养板，使用多通道P200移液器（设定体积为75 µL），从第一行孔的边缘缓慢吸取培养基。吸液完成后，迅速将培养基重新排回孔中，以使松散的细胞和类器官悬浮。对每一行均重复此操作。
注意：该技术在此后称为“分散”，可使细胞碎片和类器官进入悬浮状态。类器官会迅速沉降至孔底，而较小的碎片则保持悬浮，从而可在换液时被去除。这有助于防止类器官在培养过程中停留在细胞碎片中。
- 所有孔完成分散操作后，静置15秒，确保类器官已沉降至各孔底部。
- 使用多通道P200移液器缓慢而小心地从每个孔中吸出75 µL培养基，并排入废液容器。
注意：多数使用者在常规换液时偶尔会吸出类器官，发生概率约为1%。请合理规划实验，确保有足够数量的类器官能够存活至实验终点。
- 将SCMM + Y-27632溶液转移至试剂储液槽中，使用多通道P200移液器向每个类器官培养孔中加入150 µL。
- 将培养板放回37 °C培养箱中继续培养。
3. 脑类器官的维持（第3天）
- 将17 mL SCMM预热至37 °C，此次不添加Y-27643。
- 将多通道P200移液器设定为100 µL，吹打类器官板的所有孔（参见步骤2.2）。等待15秒，确保类器官已沉降至孔底。
- 准备废液储液槽，并将预热的SCMM转移至供液储液槽中。
- 使用多通道P200移液器小心吸去每孔中的125 µL培养基，并加入150 µL新鲜SCMM进行替换。
- 将板放回37 °C培养箱中继续培养。
4. 脑类器官的维持（第4天及以后）
注意：每隔一天进行一次常规维护，直至感染发生。
- 在第4天开始换液前，配制神经诱导（NI）培养基。
- 解冻一份250 µL的2 mg/mL肝素溶液，以及一瓶5 mL的100倍N-2补充剂。将250 µL肝素、5 mL 100X N-2补充剂和5 mL 100X最低必需培养基-非必需氨基酸（MEM-NEAA）加入500 mL的杜氏改良伊格尔培养基/营养混合物F-12（DMEM/F12）+ GlutaMAX中。使用500 mL滤器对混合溶液进行无菌过滤。
注意：不使用时将NI培养基保存在4 °C；NI培养基最多可保存两周，之后需配制新鲜培养基。
- 将17 mL NI培养基预热至37 °C。
- 将多通道P200移液器设定为100 µL，吹打分散类器官板的所有孔（参见步骤2.2）。静置15秒，确保类器官沉降至孔底。
- 准备废液储液槽，并将预热的NI培养基转移至供液储液槽中。
- 使用多通道P200移液器小心吸出每孔125 µL培养基，并替换为125 µL新鲜NI培养基。
- 将培养板放回37 °C培养箱中继续培养。
5. 类器官感染寨卡病毒（ZIKV）（约第24天）
注意：经过约3周的分化后，类器官内将出现较大的神经上皮结构和玫瑰花环样结构，这些结构对寨卡病毒（ZIKV）感染高度易感。
- 将 Earle's 1X 平衡盐溶液（EBSS）、1X 磷酸盐缓冲液（PBS）和 NI 置于水浴锅中加热至 37 °C。
- 将已知浓度的 ZIKV 用 1X EBSS 稀释至目标感染复数（MOI）。
注意：建议进行不同 MOI 的滴定实验，以获得病毒剂量反应曲线。该数值可能因病毒株而异；对于 ATCC VR-1838 和 ATCC VR-1843，典型的 MOI 值范围为 0.1 至 10。
- 使用单通道 P200 移液器小心吸除类器官孔中的全部培养基。随后使用多通道 P200 移液器快速向每孔加入 200 µL 的 1X PBS，以洗涤类器官。
- 使用单通道 P200 移液器小心吸除类器官孔中的全部液体。迅速向每孔加入 50 µL 的仅含 1X EBSS（模拟感染）或含 ZIKV 病毒的溶液，并确保类器官完全浸没。对研究中所有需感染的类器官重复此步骤。
- 将培养板放回 37 °C 培养箱中孵育 2 小时。
注意：模拟感染的类器官在此条件下孵育不应对其生长产生显著影响，与未受干扰的类器官相比无明显差异。
- 在病毒孵育结束前约 30 分钟，将 25 mL NI 分装至 50 mL 锥形管中，并置于水浴锅中加热至 37 °C。
- 完成病毒暴露后，用每孔 200 µL 的 1X PBS 洗涤类器官，静置 15 秒使类器官沉降，然后使用单通道 P200 移液器吸除 1X PBS。
- 向每孔加入 200 µL 新鲜 NI，并将培养板放回培养箱继续培养。
- 可选：若需设置第 0 天时间点，可在感染后 1 小时对类器官进行成像观察。
- 采用分散法每隔一天更换 125 µL NI 继续培养（参见步骤 4）。务必妥善处理废弃的培养基和移液枪头，因其可能含有传染性 ZIKV 病毒颗粒。