通过双染色法评估小脑神经元培养物中的神经元活力

本文内容

摘要

本视频展示了使用荧光素二乙酸酯（FDA）和碘化丙啶（PI）双染色法，从混合培养的小脑颗粒神经元和胶质细胞中鉴定神经元的方法，其中活神经元呈绿色，死神经元呈红色。

方案

1. FDA-PI 双重染色及在小脑颗粒神经元（CGN）培养中的应用

通过在10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中加入20 µL FDA储备液（终浓度：10 µg/mL）和50 µL PI储备液（终浓度：50 µg/mL），配制荧光素二乙酸酯-碘化丙啶（FDA-PI）工作液。涡旋混匀后置于冰上。
注意： FDA-PI工作液需在使用前新鲜配制。
从培养箱中取出细胞培养板，置于冰上。
吸除培养基，更换为冷的PBS。
注意： 换液操作必须缓慢且小心，避免移液枪头接触细胞。
吸除冷的PBS，每孔加入冷的FDA-PI工作液（12孔板每孔500 µL，6孔板每孔1 mL），冰上孵育5分钟。
吸除FDA-PI工作液，每孔加入冷的PBS（12孔板每孔100 µL，6孔板每孔50 µL）。
注意： 成像过程中应避免细胞干燥。
使用荧光显微镜进行成像。激发滤光片通带为450–490 nm，分别在520 nm和620 nm检测FDA和PI的荧光发射信号。在相同条件下，利用荧光显微镜的相差模式在明场下拍摄一张图像。
注意： 应在加入FDA-PI后15分钟内完成成像。曝光时间为100–300 ms，模拟增益为2.8倍。

2. 神经元存活率的评估

进行 FDA-PI 双重染色时，在图像编辑软件中通过将 FDA 阳性层拖动到 PI 阳性层上来叠加经不同荧光滤光片筛选后检测到的细胞图像。
1. 在“图层”面板的“不透明度”字段中输入“50%”，以调整 FDA 阳性层的不透明度。点击“图层”菜单中的“合并可见图层”按钮，将两个图层合并。在“图像”|“调整”|“亮度/对比度”下的“对比度”字段中输入“50”，以设置叠加图像的对比度。确保叠加图像中不存在 FDA 和 PI 双阳性细胞。

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材料

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