可视化蘑菇体神经元 果蝇 通过免疫染色观察大脑

摘要

来源：Kelly, S. M., 等. 成年果蝇蘑菇体与光感受器神经元的解剖及免疫荧光染色 黑腹果蝇 大脑 J. Vis. Exp. (2017).

本视频展示了一种详细的免疫染色实验方案，用于观察突变体中蘑菇体的表型缺陷 果蝇 大脑。该方案涉及使用针对Fas2的抗体，Fas2是一种参与轴突导向的蛋白质，有助于蘑菇体的正常形态和功能发育。

方案

1. 固定与免疫荧光染色步骤

1. 使用 p200 移液器将解剖好的脑组织从 9 孔板转移至装有 0.5 mL 4% 多聚甲醛（用 PTN 稀释，PTN 为 0.1 M 磷酸钠缓冲液 pH 7.2，含 0.1% 非离子型表面活性剂）的 0.5 mL 微量离心管中。相同基因型的至少 10–15 个脑组织可合并置于同一微量离心管中。所有后续步骤（直至将脑组织封片）均在 0.5 mL 微量离心管中完成。
   注意：多聚甲醛（PFA）应在通风橱中操作。PFA 废液应收集并妥善处理。购自玻璃安瓿瓶的 20% 多聚甲醛可分装至微量离心管中，于 -20 °C 保存备用。
2. 在通风橱内，将脑组织置于 4% 多聚甲醛中，室温下低速振荡孵育 20 分钟。
3. 固定完成后，让脑组织依靠重力自然沉降至微量离心管底部。
   注意：脑组织有时会粘附在微量离心管壁上。若发生此情况，通常可通过食指与拇指轻轻横向旋转管体，或轻敲管壁以促进脑组织下沉。
4. 使用 p1000 移液器吸除固定液，并用 500 μL PTN 进行两次“快速”洗涤，每次洗涤之间让脑组织沉降至管底。在这些快速洗涤过程中，一旦所有脑组织依靠重力沉降至管底，即可立即更换为新鲜缓冲液；无需额外洗涤时间。
   注意：通常建议在管中保留少量缓冲液，以避免误吸出脑组织。需仔细检查移液器吸头，确保未误吸脑组织。若脑组织被吸入吸头，应将其重新排回微量离心管中，待其沉降后，再继续吸除剩余 PTN。
5. 最后一次快速洗涤后，使用 p1000 移液器进行三次“长时间”洗涤：每次加入 500 μL PTN，在摇床或振荡器上室温孵育 20 分钟。此后所有“长时间”洗涤均应持续 20 分钟。
   注意：固定后的脑组织可在 PTN 中于 4 °C 过夜保存。
6. 使用 p1000 移液器吸除最后一次洗涤液，加入 0.5 mL 封闭液 [PTN + 5% 正常山羊血清（NGS）]，在摇床或振荡器上室温孵育至少 30 分钟。
   1. 后续步骤将使用山羊来源的二抗。若使用其他物种的二抗，则封闭液和抗体溶液中应使用该物种的正常血清（而非 NGS）。
7. 使用 p1000 移液器吸除封闭液，加入用 PTN 稀释的一抗溶液（PTN + 5% NGS + 稀释后的一抗）。首次使用某一种一抗时，其最佳稀释比例应通过实验确定。
   注意：为观察蘑菇体神经元，通常使用识别 Fas2 的抗体。该抗体可从发育研究杂交瘤库（DSHB）获得，编号为 1D4，建议在 PTN + 5% NGS 中按 1:20 稀释。
8. 将脑组织在含一抗的溶液中置于摇床或振荡器上，于 4 °C 孵育 2–3 夜。
9. 一抗孵育结束后，让脑组织沉降至微量离心管底部，然后吸除一抗溶液。
10. 使用 p1000 移液器，按照步骤 1.4 和 1.5 所述方法，用 0.5 mL PTN 进行两次“快速”洗涤和三次“长时间”20 分钟洗涤，每次洗涤之间均需让脑组织依靠重力沉降至管底。
11. 在室温下用适当荧光标记的二抗孵育脑组织 3 小时。二抗通常用 0.5 mL PTN + 5% NGS 按 1:200 稀释。
    注意：一旦加入荧光标记的二抗，后续实验过程中脑组织应始终避光。
12. 二抗孵育结束后，让脑组织沉降至微量离心管底部，然后吸除二抗溶液。
13. 使用 p1000 移液器，按照步骤 1.4 和 1.5 所述方法，用 0.5 mL PTN 进行两次“快速”洗涤和三次“长时间”20 分钟洗涤，每次洗涤之间均需让脑组织依靠重力沉降至管底。
14. 第三次“长时间”20 分钟洗涤后，使用 p200 移液器尽可能吸除管中缓冲液。
15. 向脑组织中加入 75 μL 荧光抗淬灭封片介质。用移液器吸打一次以混匀脑组织与封片介质。切勿倒置离心管，以免脑组织粘附于管盖或管壁。
    注意：脑组织悬浮于封片介质后，可将离心管用铝箔包裹以减缓荧光淬灭，并于 4 °C 过夜保存。如有必要，脑组织可在 4 °C 保存数天，但最好尽快封片。

2. 将成年黑腹果蝇（D. melanogaster）大脑固定于显微镜载玻片上并进行成像

1. 制备“桥接”载玻片。将两个“基底”盖玻片放置在带正电荷的载玻片上，两者相距约 1 cm。确保载玻片的带正电荷面朝上。用指甲油将盖玻片固定在载玻片上，如图 1A所示。通常建议用指甲油密封每个基底盖玻片的三个外侧边缘，以防止封片剂渗入基底盖玻片下方。继续操作前，需让指甲油完全干燥（10–15 分钟）。
2. 将载玻片置于体视显微镜下，用移液器将含有解剖后脑组织的封片剂溶液滴加至两个盖玻片之间的空隙中。为获得更好的对比度，可调节鹅颈灯位置，使其与实验台面平行。
3. 使用移液器去除载玻片上多余的封片剂，注意避免将脑组织吸走。
4. 用滤纸吸除多余的封片剂，以便在下一步中更精确地定位脑组织。
5. 在体视显微镜下使用一对镊子将脑组织以网格状排列置于载玻片上，确保嗅觉小球（antennal lobes）朝上。
6. 将一个盖玻片（“桥接”盖玻片）覆盖在脑组织上方（图 1A）。使用指甲油密封桥接盖玻片与“基底”盖玻片接触的两侧。
7. 使用 P200 移液器，缓慢将新鲜的封片剂注入桥接盖玻片下方的中央空腔（图 1B）。每次在中央盖玻片的开口边缘滴加一滴封片剂，使其通过毛细作用渗入桥接盖玻片下方。持续操作直至整个空腔被封片剂充满，然后用透明指甲油密封顶部和底部开口。
8. 待指甲油完全干燥后，立即进行成像，或置于避光、密封的载玻片盒中，于 -20 °C 保存。
9. 在一周内，使用激光扫描共聚焦显微镜对脑组织进行成像，选择与所用荧光二抗相匹配的激发激光和滤光片组。蘑菇体神经元的Z轴层扫图像通常使用 20X 或 40X 物镜获取。

结果

图 1. 脑组织的封片制备，用于免疫荧光成像。（A）将脑组织置于SuperFrost Plus载玻片上，并使用桥式盖玻片防止脑组织压扁。将两个“基底”盖玻片用透明指皮胶粘附在带正电荷的SuperFrost Plus载玻片上，解剖得到的脑组织置于二者之间。然后在脑组织上方放置一个透明的“桥式”盖玻片，并将其粘附在基底盖玻片上。（B）待指皮胶完全干燥后，缓慢将Vectashield通过移液方式注入桥式盖玻片下方，以保护二抗的荧光信号。随后使用透明指皮胶密封“桥式”盖玻片的顶部和底部边缘。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
显微解剖镊	Ted Pella	505-NM
Sylgard 培养皿	Living Systems Instrumentation	DD-50-S-BLK	可从 amazon.com 购买
Fas2 抗体	发育研究杂交瘤库（Developmental Studies Hybridoma Bank）	1D4
Chaoptin 抗体	发育研究杂交瘤库（Developmental Studies Hybridoma Bank）	24B10
GFP 抗体	Aves Lab	GFP-1010
Alexa488 山羊抗小鼠 二抗	ThermoFisher	A-11001
Alexa488 山羊抗鸡 二抗	ThermoFisher	A-11039
Alexa647 山羊抗小鼠二抗	ThermoFisher	A-21236
20% 戊二醛	电子显微镜服务公司（Electron Microscope Services）	RT15713
VectaShield	Vector Labs	H-1000
SuperFrost Plus 载玻片	ThermoFisher	99-910-01
盖玻片	ThermoFisher	12-553-454
磷酸二氢钠缓冲液（Na Phosphate Buffer monobasic）	Sigma	S3139
磷酸氢二钠缓冲液（Na phosphate Buffer dibasic）	Sigma	S3264
Triton X-100	Sigma	X100-100ml
指甲油	电子显微镜服务公司（Electron Microscope Services, EMS）	72180
体视显微镜	Leica S6D 配 KL300 LED 光源
9 孔板（点样板）	VWR	89090-482
旋转/摇动仪（nutator/rocker）	Fisher	22-363-152 或 88-861-041
35 mm 培养皿	Genesee Scientific	32-103
Sylgard	Fisher	50-366-794
Kimwipe 擦镜纸	Fisher	06-666
可能使用的固定缓冲液
PTN 缓冲液			0.1 M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100，通常配制 0.5 L 的 0.1 M NaPhosphate 缓冲液，并根据需要每次分装 50 ml
可从 Bloomington 获得的果蝇品系
elav (c155)-GAL4		BL458	泛神经元 GAL4 驱动子
w*;;;OK107-GAL4		BL 854	所有蘑菇体神经元的 GAL4 驱动子（OK107-GAL4 插入位于第 4 号染色体）
y(1), w(67c23); c739-GAL4		BL 7362	α 和 β 叶的 GAL4 驱动子（位于第 2 号染色体）
y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS-CD8-GFP		BL 64305	α 和 β 叶的 GAL4 驱动子，同时含有 UAS-CD8-GFP
w*; 201Y-GAL4		BL 4440	主要驱动蘑菇体 γ 叶的 GAL4（位于第 2 号染色体）
y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, UAS-CD8-GFP		BL 64296	蘑菇体 γ 叶的 GAL4 驱动子，同时含有 UAS-CD8-GFP