通过脂多糖注射在斑马鱼幼鱼中诱导神经炎症

摘要

来源：He, Y. 等. 向幼年斑马鱼脑室微量注射脂多糖以评估神经炎症与神经毒性。J. Vis. Exp. (2022)。

该视频演示了将脂多糖（LPS）显微注射到斑马鱼幼鱼脑内以诱导神经炎症的过程。将幼鱼置于铺有琼脂糖的培养皿中，将注射针插入脑室，注入LPS。注入的LPS会触发免疫反应，从而导致神经炎症。

方案

1. 显微注射前的准备

1. 使用显微注射拉针仪（见材料表），按照玻璃毛细管拉制的五步方案（表1）制备注射用玻璃毛细管。
2. 用镊子以适当角度打开注射针尖端（带内丝的薄壁玻璃毛细管[3.5英寸]，外径[OD]为1.14 mm），使其达到合适的尺寸（图1A）。
3. 向针内注入0.1 mL矿物油，确保无气泡存在。
4. 取下显微注射装置钢针上的螺帽，将玻璃针的孔与钢针对齐后拧紧螺帽。将装好针的显微注射装置固定在显微操作仪上（见材料表）。
5. 调整显微注射装置的位置，使显微操作仪可在显微镜下灵活移动该装置。排出一定体积的石蜡油，使钢针进入毛细玻璃管内。
6. 在经70%乙醇灭菌的载玻片上滴加注射溶液（如1×磷酸盐缓冲液（PBS）或5 mg/mL LPS），并调节显微注射装置，使针尖插入液滴中，将约2 µL注射溶液吸入针内。
7. 设置显微操作仪（上下左右微调参数），使显微注射装置的针尖与幼虫在高倍镜下处于同一视野中（图1B）。

2. 斑马鱼显微注射的固定

注意：斑马鱼大脑的发育在受精后3天内完成，并在5天后达到成熟，此时中枢神经系统已充分发育。因此，5天后的幼鱼已适用于研究脂多糖（LPS）介导的神经损伤以及行为和炎症反应。

1. 在斑马鱼幼鱼达到目标发育阶段后约30分钟内进行注射，以保持注射时间的一致性。
2. 为麻醉斑马鱼幼鱼，将三卡因（tricaine）与洁净的鱼缸水混合（三卡因终浓度为0.02% w/v）。
3. 使用微波炉融化2%琼脂糖的双蒸水（ddH₂O）溶液。将融化的琼脂糖倒入塑料培养皿中。涂有2%琼脂糖的塑料培养皿可在4 °C保存最多2周。
4. 使用塑料移液管将麻醉后的幼鱼转移至2%琼脂糖包被的塑料培养皿中央。将固定好的幼鱼调整为脑侧朝上，以便进针。

3. 脑室注射

1. 调节显微镜放大倍数，使斑马鱼脑室结构在视野中清晰可见（图1B）。
2. 使用显微操作器将注射针小心地置于视顶盖上方（图1C）。
3. 用显微操作器缓慢地以针尖刺破斑马鱼脑部皮肤。
4. 踩下脚踏开关，注入1 nL的1×PBS或不同浓度的LPS（1.0、2.5和5.0 mg/mL）（参见材料表）。成功注射至脑室的示例图像显示了向脑室注入1 nL 1%伊文思蓝染料（溶于PBS）的结果（图1D）。注射后立即将幼鱼转移至洁净的卵水（E3）培养基中。24小时后，收集幼鱼用于显微成像、运动行为检测及其他指标测定。

结果

表1：玻璃毛细管拉制的五步方案。

步骤	操作时间（秒）	加热水平	操作
T1	L>	H80-89	P1L005
T2	1.6-3	H00
T3	L>	H00	P2L001c

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖	Sigma-Aldrich	A6361
低凝胶温度琼脂糖	Sigma-Aldrich	A9414
Drummond Nanoject III 可编程纳升级注射仪	Drummond Scientific	3-000-207
荧光体视显微镜	Leica	M205 FA
大肠杆菌 O111:B4 脂多糖	Sigma-Aldrich	L3024
手动显微操作器	World Precision Instruments	M3301
矿物油	Sigma-Aldrich	M5904
磷酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich	P4417
带纤维的薄壁玻璃毛细管（4"），外径 1.5 mm	World Precision Instruments	TW150F-4
三卡因（3-氨基苯甲酸乙酯）	Sigma-Aldrich	A-5040