小鼠小脑颗粒神经元活性氧诱导的神经元死亡建模

1. 实验准备

注意:以下储备液可以制备并维护至使用。

1. 解剖解决方案
   1. 将 3.62 g 氯化钠 （NaCl）、0.2 g 氯化钾 （KCl）、0.069 g 磷酸钠 （NaH₂PO₄ ∙ H₂O） 和 1.306 g D-（+）-葡萄糖溶解在 500 mL 蒸馏的 H₂O 中。然后，向溶液中加入 12.5 mL HEPES 缓冲液、450 μL 酚红溶液和 20 mL 牛血清白蛋白 （BSA） 组分 V。使用 1 N 氢氧化钠 （NaOH） 调节至 pH 7.4。
   2. 用 0.22 μm 过滤器消毒并储存在 4 °C。该溶液将保持稳定长达 1 周至 10 天。
2. 胰蛋白酶
   1. 制备浓度为 25 g/L 胰蛋白酶的 0.9% 氯化钠储备液。将溶液储存在 -20 °C。
3. 胰蛋白酶抑制剂
   1. 通过将 1 g 蛋清胰蛋白酶抑制剂溶解在 100 mL 1 mM HCl 中，制备浓度为 10 mg/mL 的原液。将此溶液储存在 -20 °C。
4. 脱氧核糖核酸酶 （DNase）
   1. 将 100 mg DNase 1 溶于 10 mL 无菌水中，得到 10 mg/mL 原液。将溶液储存在 -20 °C。
5. 硫酸镁₄
   1. 将 6.02 g 硫酸镁 （MgSO₄） 添加到 50 mL 蒸馏水 （H₂O） 中，生成 1 M 原液。将溶液储存在 4 °C。
6. 氯化钙₂
   1. 将 0.735 g 氯化钙 （CaCl₂∙ 2H₂O） 溶解在 50 mL 蒸馏的 H₂O 中，至储备浓度为 100 mM。将溶液储存在 4 °C。
7. 氯化钾
   1. 将 3.7275 g KCl 溶解在 50 mL 蒸馏的 H₂O 中，至储备浓度为 1 M。将溶液储存在 4 °C。
8. D-（+）-葡萄糖
   1. 将 1.802 g D-（+）-葡萄糖溶解在 50 mL 蒸馏的 H₂O 中，至储备浓度为 100 mM。将溶液储存在 4 °C。
9. 细胞培养基
   1. 按如下方法制备细胞培养基:应将 5 mL 热灭活透析胎牛血清、500 μL 200 mM L-谷氨酰胺、100 μL 50 mg/mL 庆大霉素和 1 mL 1.0 M KCL 添加到 45 mL 过滤灭菌的 Eagle 最低必需培养基 （E-MEM） 中，补充有 1.125 g/L D-葡萄糖，生成 50 mL 小脑颗粒神经元 （CGN） 培养基。将培养基储存在 4 °C。
10. 胞嘧啶 β-D-阿拉伯呋喃糖苷
    1. 将 48 mg 胞嘧啶 β-D-阿拉伯呋喃糖苷溶解在 10 mL 生长培养基中，至储备浓度为 20 mM。将溶液储存在 -20 °C。
11. 聚-D-赖氨酸
    1. 要生成 2 mg/mL 聚 D-赖氨酸储备液，请将 10 mL 无菌 H₂O 添加到 20 mg 聚 D-赖氨酸中。储备多聚 D-赖氨酸应在 -80 °C 下以 100 μL 等分试样储存。
       注意: 以下溶液应在解剖前制备并保持在 4 °C 直至使用。
12. 补充 MgSO₄ 的解剖液
    1. 将 300 μL MgSO₄ 储备液添加到 250 mL 解剖液中。
13. 胰蛋白酶分离液
    1. 加入 100 μL 胰蛋白酶储备液和 12 μL MgSO_{储备液 4} 至 10 mL 解剖液。
14. 胰蛋白酶抑制剂溶液 1
    1. 加入 164 μL 胰蛋白酶抑制剂储备液、250 μL DNase 1 储备液和 12 μL MgSO₄ 至 10 mL 解剖液储备液。
15. 胰蛋白酶抑制剂溶液 2
    1. 加入 1040 μL 胰蛋白酶抑制剂储备液、750 μL DNase 1 储备液和 12 μL MgSO₄ 至 10 mL 解剖液储备液。
16. 补充 CaCl₂ 的解剖液
    1. 加入 10 μL CaCl₂ 储备液和 25 μL MgSO₄ 储备液至 10 mL 解剖液。
17. Poly D-赖氨酸包被培养皿
    1. 要包被培养皿，请在 40 mL 无菌 H₂O 中稀释 100 μL 多聚 D-赖氨酸储备液。对于 35 mM Nunc 培养皿，加入 2 mL 稀释的聚 D-赖氨酸溶液。对于 4 孔板，向每个孔中加入 300 μL 稀释的聚 D-赖氨酸。
    2. 让聚 D-赖氨酸静置 1 小时，然后吸出并用 4 mL 或 600 μL（分别为 35 mm 培养皿或 4 孔板）的无菌 H₂O 洗涤每个孔。然后吸出 H₂O，让培养皿风干 1 小时。

2. 小脑的脑提取和分离

1. 使用斩首剪刀斩首 6-7 天大的小鼠幼崽。在无菌组织培养罩中对大脑进行解剖。
2. 要取出大脑，请使用一把镊子抓住头部，并使用显微解剖剪刀将皮肤切向头部前部，如图 1 所示。然后使用一把新剪刀切开颅骨，以最大限度地降低污染风险。用镊子去除覆盖大脑的头骨，然后用镊子或抹刀梳理出大脑。
   1. 根据需要，切开视神经，以便于将大脑作为一个整体排出。
3. 将大脑放入补充有 MgSO₄ 的解剖溶液中。将溶液和大脑放在冰上。
4. 脑切除后，在解剖显微镜下，在补充 MgSO₄ 的解剖溶液中从大脑中解剖出小脑，并使用细镊子去除脑膜。将小脑转向其腹侧，并确保去除脉络丛。
5. 将小脑汇集到含有 ~1 mL 补充 MgSO₄ 的解剖液的 35 毫米培养皿中。
6. 将组织切成小块，然后转移到含有 30 mL MgSO₄ 缓冲解剖液的 50 mL 试管中。

3. 小鼠小脑颗粒神经元分离和培养

1. 将含有切碎脑组织的 50 mL 试管在 644 x g 和 4 °C 下离心 5 分钟。
2. 去除上清液，加入 10 mL 胰蛋白酶解剖液。然后，在 37 °C 下高速摇动试管 15 分钟。
3. 向试管中加入 10 mL 胰蛋白酶抑制剂溶液 1，轻轻摇动 2 分钟。
将
4. 试管在 644 x g 和 4 °C 下离心 5 分钟。
5. 去除上清液，加入 2 mL 胰蛋白酶抑制剂溶液 2，然后转移至 15 mL 试管中。
6. 研磨 15 mL 试管中的组织，直到溶液变得浑浊。然后静置 5 分钟。
7. 去除澄清的上清液，将上清液转移到含有 1 mL 补充 CaCl₂ 的解剖溶液的新试管中。
8. 在含有步骤 3.6 中的沉淀物的试管底部添加另一 mL 胰蛋白酶抑制剂溶液 2。再次研磨，静置 5 分钟。去除上清液，将其添加到含有步骤 3.7 中上清液的试管中（即重复步骤 3.6-3.7）。重复此过程，直到大部分组织机械解离。
9. 对于每 mL 上清液，将 0.3 mL 补充 CaCl₂ 的解剖溶液添加到上清液收集中。
10. 混合试管的内容物，然后以 644 x g 的速度离心 5 分钟。
11. 去除上清液，向沉淀中加入 10 mL 新鲜培养基并混合。
12. 然后可以计数细胞并稀释至 1.5 x 10⁶ 个细胞/mL 的浓度。请注意，一般来说，每个解剖的大脑预计有 1000 万个细胞，具体取决于胰蛋白酶消化时间和解剖效率。在先前制备的聚 D-赖氨酸板上铺板细胞。对于 4 孔板，接种 0.5 mL，每孔得到 7.5 x 10⁵ 个细胞。对于 35 mm 培养皿，接种 4 mL，每板 6 x 10⁶ 个细胞。
13. 24 小时后，向平板中添加胞嘧啶-β-阿拉伯呋喃糖苷 （AraC） 以减少神经胶质细胞污染。对于每 mL 培养基，需要 0.5 μL 的 20 mM AraC。添加 AraC 不需要更改介质。如果要将细胞维持 7-8 天，请在第 3 天重复此处理。
14. 将培养物维持在 37 °C 的 5% CO₂ 培养箱中，并在 5 天内每 2 mL 培养基中每 2 mL 添加 100 μL 100 mM 葡萄糖。不需要完全更换介质。

4. 神经元损伤建模

1. 为了诱导 ROS 诱导的细胞死亡（氧化应激），用 75-100 μM 过氧化氢 （H₂O₂） 处理神经元，并在暴露于 H₂O₂ 5 分钟后切换到平行培养物的条件培养基。请注意，由于 H₂O₂ 的不稳定性，在处理 24 小时后，将浓度优化至在培养物中诱导 50-70% 细胞死亡的水平（图 2）。

图 1:小鼠大脑的切除和小脑解剖。（A） 要提取 6-7 日龄小鼠的大脑，使用一对镊子抓住头部，并使用一把显微解剖剪刀沿虚线向前切割皮肤。小心只切开皮肤和结缔组织，切口太深可能会刺穿颅骨并损伤大脑。这三个切口，沿中线笔直，两个横向弯曲，允许将皮肤向后推，露出颅骨。一旦暴露出来，就可以用剪刀的尖端穿透头骨，并向前切割。必须非常小心，不要损伤小脑，以便于识别和去除脑膜。切割后，可以使用镊子剥开头骨，露出大脑，然后使用一对镊子或抹刀将其梳理成凉爽的解剖液。为了切除大脑，可能需要切断视神经。（B） 从颅骨中取出后，应使用一对细尖镊子从小脑中取出脑膜。（C） 使用一对细尖镊子，从剩余组织中解剖小脑并检查以确保完全去除脑膜。

图 2:小脑颗粒神经元的神经元损伤建模。 按照第 3 部分中介绍的程序，将第 6-7 天小鼠分离的小脑解离成单细胞。解离后，对细胞进行计数并重悬于一定体积的培养基中，以产生 1.5 x 106 个细胞/mL.对于 35 mm 培养皿，接种 4 mL，每板得到 6 x 106 个细胞。对于成像玻片，铺板 0.5 mL，得到 7.5 x 105 个细胞/孔。然后可以用慢病毒转导 CGN 或用腺病毒感染。在铺板当天（体外 0 天 （DIV））使用腺病毒可提供超过 90% 的转染效率，并允许研究氧化应激和 DNA 损伤引起的神经元损伤。添加 10 μM 喜树碱 （CPT） 会诱导 DNA 损伤，而添加 75-100 μM 过氧化氢 （H2O2） 会诱导氧化应激。H2O2 的浓度必须优化以在 24 小时后诱导 50% 的细胞死亡。用 5 DIV 的腺病毒感染的转导效率低于 10%。在 7 DIV 时，当 NMDA 受体在培养物中富集时，可以用 100 μM NMDA 和 10 μM 甘氨酸处理神经元以诱导兴奋性毒性。这是后续成像分析或追踪单个神经元的理想选择。最后，用 0 DIV 慢病毒转导，然后用 100 μM NMDA 和 10 μM 甘氨酸 7 DIV 处理，可提供足够高的转导效率 （>80%），以便对培养物进行生化分析，包括 ChIP 测序、检查蛋白质表达和进行活/死测定。