来源：Laaper, M. 等，在小鼠原代小脑颗粒神经元中建立神经元死亡与变性模型。J. Vis. Exp. (2017)。
本视频概述了利用活性氧（ROS）在小鼠原代小脑颗粒神经元中建立神经元损伤模型的方法。详细介绍了通过添加高浓度过氧化氢诱导氧化应激的过程。ROS暴露可导致DNA链断裂和基因组不稳定。此外，细胞蛋白的氧化会损害其功能，而脂质过氧化则破坏膜完整性。这一系列级联反应最终引发细胞色素c释放和caspase激活，导致神经元发生凋亡。
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方法文章
模拟活性氧诱导的小鼠小脑颗粒神经元死亡
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
1. 实验准备
注意：以下贮存液可预先配制并保存至使用。
- 解剖液
- 将 3.62 g 氯化钠（NaCl）、0.2 g 氯化钾（KCl）、0.069 g 磷酸二氢钠（NaH2PO4 ∙ H2O）和 1.306 g D-(+)-葡萄糖溶于 500 mL 蒸馏 H2O 中。然后向溶液中加入 12.5 mL HEPES 缓冲液、450 µL 酚红溶液和 20 mL 牛血清白蛋白（BSA）第五组分。用 1 N 氢氧化钠（NaOH）调节 pH 至 7.4。
- 使用 0.22 µm 滤器灭菌，并于 4 °C 保存。该溶液可稳定保存 1 至 10 天。
- 胰蛋白酶
- 用 0.9% 氯化钠溶液配制浓度为 25 g/L 的胰蛋白酶储备液。于 -20 °C 保存。
- 胰蛋白酶抑制剂
- 将 1 g 鸡蛋清胰蛋白酶抑制剂溶于 100 mL 1 mM 盐酸中，配制成浓度为 10 mg/mL 的储备液。于 -20 °C 保存。
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结果
图 1：小鼠脑的取出及小脑的解剖。（A）为提取一只6-7日龄小鼠的脑组织，使用一对镊子夹住头部，并用显微解剖剪沿虚线向前方剪开皮肤。注意仅剪开皮肤和结缔组织，切口过深可能刺破颅骨并损伤脑组织。这三条切口——沿中线的一条直线切口和两条向外侧弯曲的切口——可使皮肤向后推开，暴露出颅骨。暴露后，可用剪刀尖端刺穿颅骨，并向前方剪开。必须格外小心，避免损伤小脑，以便于后续识别和去除脑膜。剪开后，可用镊子将颅骨剥离，暴露脑组织，再用镊子或刮匙将其轻轻移出至冰冷的解剖液中。为取出脑组织，可能需要切断视神经。（B）脑组织从颅骨中取出后，应使用尖头镊子从小脑表面去除脑膜。（C）使用一对尖头.......
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| qPCR 慢病毒滴定试剂盒 | ABM | #LV900 | |
| 快速病毒纯化溶液 | ABM | #LV999 | |
| pCMV-dR8.2 | Addgene | #8455 | |
| pCMV-VS.VG | Addgene | #8454 | |
| 蒸馏水 | Gibco | #15230162 | |
| 200 mM L-谷氨酰胺 | Gibco | #25030081 | |
| 35 mm Nunc 培养皿 | Gibco | #174913 | |
| PowerUP SYBR Green 主混合液 | life technologies | #A25742 | |
| BSA V 溶液 | Sigma Aldrich | #A-8412 | |
| CaCl2 • 2H2O | Sigma Aldrich | #C-7902 | |
| 喜树碱 | Sigma Aldrich | #C-9911 | |
| 鸡蛋清胰蛋白酶抑制剂 | Sigma Aldrich | #10109878001 | |
| 胞嘧啶 β-D-阿拉伯呋喃糖苷 | Sigma Aldrich | #C-1768 | |
| D-(+)-葡萄糖 | Sigma Aldrich | #G-7528 | |
| DNase1 | Sigma Aldrich | #11284932001 | |
| 伊格尔最低必需培养基 | Sigma Aldrich | #M-2279 | |
| 甘氨酸 | Sigma Aldrich | #G-5417 | |
| 热灭活透析胎牛血清 | Sigma Aldrich | #F-0392 | |
| HEPES 缓冲液 | Sigma Aldrich | #H-0887 | |
| 过氧化氢 | Sigma Aldrich | #216763 | |
| 50 mg/mL 庆大霉素 | Sigma Aldrich | #G-1397 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | #M-2643 | |
| N-甲基-D-天冬氨酸 | Sigma Aldrich | #M-3262 | |
| 酚红溶液 | Sigma Aldrich | #P-0290 | |
| 胰蛋白酶 | Sigma Aldrich | #T-4549 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| p3000 增强试剂 | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| Opti-MEM I 低血清培养基 | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| KCl | VWR | #CABDH9258 | |
| NaCl | VWR | #CABDH9286 | |
| NaH2PO4H2O | VWR | #CABDH9298 | |
| 多聚 D-赖氨酸 | VWR | #89134-858 | |
| DMEM | Wisent | #319-005-CL | |
| FBS | Wisent | #080-450 |
