模拟活性氧诱导的小鼠小脑颗粒神经元死亡

摘要

来源：Laaper, M. 等，在小鼠原代小脑颗粒神经元中建立神经元死亡与变性模型。J. Vis. Exp. (2017)。

本视频概述了利用活性氧（ROS）在小鼠原代小脑颗粒神经元中建立神经元损伤模型的方法。详细介绍了通过添加高浓度过氧化氢诱导氧化应激的过程。ROS暴露可导致DNA链断裂和基因组不稳定。此外，细胞蛋白的氧化会损害其功能，而脂质过氧化则破坏膜完整性。这一系列级联反应最终引发细胞色素c释放和caspase激活，导致神经元发生凋亡。

方案

1. 实验准备

注意：以下贮存液可预先配制并保存至使用。

1. 解剖液
   1. 将 3.62 g 氯化钠（NaCl）、0.2 g 氯化钾（KCl）、0.069 g 磷酸二氢钠（NaH₂PO₄ ∙ H₂O）和 1.306 g D-(+)-葡萄糖溶于 500 mL 蒸馏 H₂O 中。然后向溶液中加入 12.5 mL HEPES 缓冲液、450 µL 酚红溶液和 20 mL 牛血清白蛋白（BSA）第五组分。用 1 N 氢氧化钠（NaOH）调节 pH 至 7.4。
   2. 使用 0.22 µm 滤器灭菌，并于 4 °C 保存。该溶液可稳定保存 1 至 10 天。
2. 胰蛋白酶
   1. 用 0.9% 氯化钠溶液配制浓度为 25 g/L 的胰蛋白酶储备液。于 -20 °C 保存。
3. 胰蛋白酶抑制剂
   1. 将 1 g 鸡蛋清胰蛋白酶抑制剂溶于 100 mL 1 mM 盐酸中，配制成浓度为 10 mg/mL 的储备液。于 -20 °C 保存。
4. 脱氧核糖核酸酶（DNase）
   1. 将 100 mg DNase 1 溶于 10 mL 无菌水中，配制成浓度为 10 mg/mL 的储备液。于 -20 °C 保存。
5. MgSO₄
   1. 将 6.02 g 硫酸镁（MgSO₄）加入 50 mL 蒸馏水（H₂O）中，配制成 1 M 储备液。于 4 °C 保存。
6. CaCl₂
   1. 将 0.735 g 氯化钙（CaCl₂∙ 2H₂O）溶于 50 mL 蒸馏 H₂O 中，配制成 100 mM 储备液。于 4 °C 保存。
7. KCl
   1. 将 3.7275 g KCl 溶于 50 mL 蒸馏 H₂O 中，配制成 1 M 储备液。于 4 °C 保存。
8. D-(+)-葡萄糖
   1. 将 1.802 g D-(+)-葡萄糖溶于 50 mL 蒸馏 H₂O 中，配制成 100 mM 储备液。于 4 °C 保存。
9. 细胞培养基
   1. 按如下方式配制细胞培养基：向 45 mL 经滤膜灭菌并添加了 1.125 g/L D-葡萄糖的 Eagle 最低必需培养基（E-MEM）中加入 5 mL 热灭活透析胎牛血清、500 µL 200 mM L-谷氨酰胺、100 µL 50 mg/mL 庆大霉素和 1 mL 1.0 M KCl，以制备 50 mL 小脑颗粒神经元（CGN）培养基。于 4 °C 保存培养基。
10. 阿糖胞苷
    1. 将 48 mg 阿糖胞苷溶于 10 mL 生长培养基中，配制成 20 mM 储备液。于 -20 °C 保存。
11. 多聚赖氨酸（Poly-D-Lysine）
    1. 为配制 2 mg/mL 的多聚赖氨酸储备液，将 20 mg 多聚赖氨酸溶于 10 mL 无菌 H₂O 中。多聚赖氨酸储备液应分装为 100 µL 每份，于 -80 °C 保存。
       注意：以下溶液应在解剖前配制，并在使用前保持 4 °C 保存。
12. 添加 MgSO₄ 的解剖液
    1. 向 250 mL 解剖液中加入 300 µL MgSO₄ 储备液。
13. 含胰蛋白酶的解剖液
    1. 向 10 mL 解剖液中加入 100 µL 胰蛋白酶储备液和 12 µL MgSO₄ 储备液。
14. 胰蛋白酶抑制剂溶液 1
    1. 向 10 mL 解剖液中加入 164 µL 胰蛋白酶抑制剂储备液、250 µL DNase 1 储备液和 12 µL MgSO₄ 储备液。
15. 胰蛋白酶抑制剂溶液 2
    1. 向 10 mL 解剖液中加入 1040 µL 胰蛋白酶抑制剂储备液、750 µL DNase 1 储备液和 12 µL MgSO₄ 储备液。
16. 添加 CaCl₂ 的解剖液
    1. 向 10 mL 解剖液中加入 10 µL CaCl₂ 储备液和 25 µL MgSO₄ 储备液。
17. 多聚赖氨酸包被的培养皿
    1. 为包被培养皿，将 100 µL 多聚赖氨酸储备液用 40 mL 无菌 H₂O 稀释。对于 35 mm Nunc 培养皿，每皿加入 2 mL 稀释后的多聚赖氨酸溶液；对于 4 孔板，每孔加入 300 µL 稀释后的多聚赖氨酸溶液。
    2. 室温孵育 1 小时后，吸除液体，并分别用 4 mL 或 600 µL（对应 35 mm 培养皿或 4 孔板）无菌 H₂O 洗涤各孔。吸除 H₂O 后，让培养皿在空气中干燥 1 小时。

2. 大脑提取与小脑分离

1. 使用剪头剪剪掉一只6–7日龄幼鼠的头部。在无菌组织培养罩内进行脑组织的解剖。
2. 取出脑组织时，用镊子夹住头部，用显微解剖剪沿头部前方剪开皮肤，如图1所示。然后使用一把新的剪刀剪开颅骨，以尽量减少污染风险。用镊子移除覆盖脑组织的颅骨，并用镊子或刮匙小心分离出脑组织。
   1. 必要时可剪断视神经，以便完整取出脑组织。
3. 将脑组织放入含有MgSO₄的解剖液中，并将溶液和脑组织置于冰上保存。
4. 取出脑组织后，在解剖显微镜下，于含MgSO₄的解剖液中分离小脑，并用精细镊子去除脑膜。将小脑翻转至腹侧，确保彻底清除脉络丛。
5. 将分离的小脑组织收集至一个直径35 mm的培养皿中，内含约1 mL添加MgSO₄的解剖液。
6. 将组织切成小块，转移至含有30 mL含MgSO₄缓冲解剖液的50 mL离心管中。

3. 小鼠小脑颗粒神经元的分离与培养

1. 将含有切碎脑组织的50 mL离心管在644 × g、4 °C条件下离心5分钟。
2. 弃去上清液，加入10 mL胰蛋白酶消化液，然后在37 °C下高速振荡15分钟。
3. 向离心管中加入10 mL胰蛋白酶抑制剂溶液1，轻轻摇晃2分钟。
4. 将离心管在644 × g、4 °C条件下离心5分钟。
5. 弃去上清液，加入2 mL胰蛋白酶抑制剂溶液2，然后转移至15 mL离心管中。
6. 在15 mL离心管中吹打组织直至溶液变浑浊，静置5分钟。
7. 弃去澄清的上清液，并将上清液转移至另一新离心管中，该管内含有1 mL添加了CaCl₂的消化液。
8. 向步骤3.6中沉淀物所在的离心管底部再加入1 mL胰蛋白酶抑制剂溶液2，再次吹打并静置5分钟。弃去上清液，并将其加入步骤3.7中已收集上清液的离心管中（即重复步骤3.6–3.7）。重复此过程，直至大部分组织被机械解离。
9. 每毫升收集的上清液中加入0.3 mL添加了CaCl₂的消化液。
10. 混匀离心管内容物，然后在644 × g条件下离心5分钟。
11. 弃去上清液，向沉淀物中加入10 mL新鲜培养基并混匀。
12. 随后可对细胞进行计数，并稀释至浓度为1.5 × 10⁶ 个细胞/mL。请注意，通常每个解剖得到的脑组织可获得约一千万个细胞，具体数量取决于胰蛋白酶消化时间和解剖效率。将细胞接种至预先制备的多聚D-赖氨酸包被的培养板中。对于4孔板，每孔接种0.5 mL，即每孔7.5 × 10⁵ 个细胞；对于35 mm培养皿，每皿接种4 mL，即每皿6 × 10⁶ 个细胞。
13. 24小时后，向培养板中加入胞嘧啶-β-阿拉伯糖苷（AraC）以减少胶质细胞污染。每毫升培养基需加入0.5 µL的20 mM AraC。添加AraC时无需更换培养基。若需将细胞维持培养7–8天，则应在第3天重复一次该处理。
14. 将培养物置于37 °C、5% CO₂的培养箱中培养，并从第5天起每隔2天向每2 mL培养基中补充100 µL的100 mM葡萄糖溶液。无需进行完全换液。

4. 神经元损伤建模

1. 为诱导活性氧（ROS）介导的细胞死亡（氧化应激），用 75–100 µM 过氧化氢（H₂O₂）处理神经元，并在 H₂O₂ 暴露 5 分钟后更换为平行培养物的条件培养基。注意，由于 H₂O₂ 不稳定，需优化其浓度，使其在处理 24 小时后在培养物中诱导 50–70% 的细胞死亡（图 2）。

结果

图 1：小鼠脑的取出及小脑的解剖。（A）为提取一只6-7日龄小鼠的脑组织，使用一对镊子夹住头部，并用显微解剖剪沿虚线向前方剪开皮肤。注意仅剪开皮肤和结缔组织，切口过深可能刺破颅骨并损伤脑组织。这三条切口——沿中线的一条直线切口和两条向外侧弯曲的切口——可使皮肤向后推开，暴露出颅骨。暴露后，可用剪刀尖端刺穿颅骨，并向前方剪开。必须格外小心，避免损伤小脑，以便于后续识别和去除脑膜。剪开后，可用镊子将颅骨剥离，暴露脑组织，再用镊子或刮匙将其轻轻移出至冰冷的解剖液中。为取出脑组织，可能需要切断视神经。（B）脑组织从颅骨中取出后，应使用尖头镊子从小脑表面去除脑膜。（C）使用一对尖头...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
qPCR 慢病毒滴定试剂盒	ABM	#LV900
快速病毒纯化溶液	ABM	#LV999
pCMV-dR8.2	Addgene	#8455
pCMV-VS.VG	Addgene	#8454
蒸馏水	Gibco	#15230162
200 mM L-谷氨酰胺	Gibco	#25030081
35 mm Nunc 培养皿	Gibco	#174913
PowerUP SYBR Green 主混合液	life technologies	#A25742
BSA V 溶液	Sigma Aldrich	#A-8412
CaCl2 • 2H2O	Sigma Aldrich	#C-7902
喜树碱	Sigma Aldrich	#C-9911
鸡蛋清胰蛋白酶抑制剂	Sigma Aldrich	#10109878001
胞嘧啶 β-D-阿拉伯呋喃糖苷	Sigma Aldrich	#C-1768
D-(+)-葡萄糖	Sigma Aldrich	#G-7528
DNase1	Sigma Aldrich	#11284932001
伊格尔最低必需培养基	Sigma Aldrich	#M-2279
甘氨酸	Sigma Aldrich	#G-5417
热灭活透析胎牛血清	Sigma Aldrich	#F-0392
HEPES 缓冲液	Sigma Aldrich	#H-0887
过氧化氢	Sigma Aldrich	#216763
50 mg/mL 庆大霉素	Sigma Aldrich	#G-1397
MgSO4	Sigma Aldrich	#M-2643
N-甲基-D-天冬氨酸	Sigma Aldrich	#M-3262
酚红溶液	Sigma Aldrich	#P-0290
胰蛋白酶	Sigma Aldrich	#T-4549
Lipofectamine 3000	Thermo Fisher Scientific	L3000-008
p3000 增强试剂	Thermo Fisher Scientific	L3000-008
Opti-MEM I 低血清培养基	Thermo Fisher Scientific	31985070
KCl	VWR	#CABDH9258
NaCl	VWR	#CABDH9286
NaH2PO4H2O	VWR	#CABDH9298
多聚 D-赖氨酸	VWR	#89134-858
DMEM	Wisent	#319-005-CL
FBS	Wisent	#080-450