来源：Quintanilla, L. J.，等。检测成年海马神经前体细胞的环路特异性调控。J. Vis. Exp. （2019）
本视频演示了利用EdU掺入法对脑组织切片中新生增殖的神经干细胞进行染色，随后通过免疫荧光技术可视化特定蛋白，以增强对细胞动态及增殖过程的理解。
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方法文章
小鼠脑切片中增殖神经干细胞的免疫荧光染色可视化
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。
1. 免疫组织化学
- 胸苷类似物染色
- 将组织切片置于磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，并将5−8个连续切片按从前到后的顺序贴附于带正电荷的载玻片上，保持方向一致。待切片完全干燥以牢固粘附于载玻片后，使用疏水笔或PAP笔在周围画出封闭边界。
- 使用通透缓冲液（0.5% TBS-吐温，TBS为三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水）对切片通透处理20−30分钟，随后用TBS-吐温洗涤2次，每次5分钟。
注意：通透处理有助于抗体进入细胞内。通透时间可根据组织厚度和抗体效率进行调整。也可通过提高去污剂浓度来增强通透效果，但需注意避免通透时间过长，以免因组织脆弱性增加而导致切片破损。 - 根据表1配制Edu（5-乙炔基-2'-脱氧尿苷）反应液。最终在1 mL Edu反应液中，Alexa488-叠氮化物的浓度为15 µM。
- 将切片在Edu反应液中孵育30分钟至1小时，随后用TBS-吐温洗涤3次，每次5分钟。此步骤后，用铝箔包裹载玻片以避光。此时可使用荧光显微镜检查Edu反应是否成功。Edu标记的细胞在落射荧光显微镜下会发出荧光。
- 已贴附组织切片的免疫染色流程
- 使用与二抗来源相同的动物血清（如驴血清）配制的封闭液，对第1.1.4步中已贴附于载玻片的组织切片进行封闭处理30分钟至1小时，随后用TBS-吐温洗涤2次，每次5分钟。
- 在封闭过程中，将一抗（例如鸡抗nestin抗体）按1:200比例溶于封闭液中配制一抗溶液。每张载玻片使用250 µL即可确保组织完全浸没于溶液中。
- 封闭并洗涤后，在室温下将组织切片与一抗溶液孵育过夜。可根据所用一抗的特性对此步骤进行调整。
注意：若抗体存在高背景或非特异性结合，改用4 °C孵育而非室温可能改善结果。对于组织穿透能力较差的抗体，必要时可延长孵育至2天。 - 用TBS-吐温将切片洗涤3次，每次5分钟，以去除未结合的一抗。随后将切片与荧光标记的二抗（例如Alexa 647标记的抗鸡二抗，按1:200稀释于封闭液中）在室温下孵育2小时。
- 再次用TBS-吐温洗涤切片3次，每次5分钟，以去除未结合的二抗。然后在室温下用PBS稀释1:100的300 µM DAPI（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚）溶液孵育15分钟。
- 用PBS将切片洗涤3次，每次5分钟，以去除多余的DAPI染料，并用棉签或精细擦拭纸擦去组织周围的PAP笔画线。待切片干燥后，滴加封片剂并加盖盖玻片。待封片剂完全干燥后即可进行成像。
表1：免疫组织化学所用溶液
| 抗冻溶液 | 乙二醇 150 mL + 蔗糖 150 g + 用 0.1 M 磷酸缓冲液定容至 500 mL，配制成 500 mL 溶液 |
| 柠檬酸盐缓冲液 | 9 mL 柠檬酸贮存液 + 41 mL 三钠柠檬酸缓冲液 + 450 mL 去离子水2O |
| 柠檬酸储备液 | [0.1 M] 柠檬酸 21 g/1 L ddH₂O2O |
| 三水合柠檬酸钠储备液 | [0.1 M] 三水合柠檬酸钠 29.4 g/1 L ddH₂O2O |
| Tris 缓冲盐溶液-吐温（TBS-吐温） | TBS 中含 0.05% 100-x Triton |
| 透化缓冲液 | TBS 中含 0.5% 100-x Triton |
| 封闭缓冲液 | 0.33 mL 驴血清加入 10 mL TBS-Triton 中 |
| Edu反应溶液 | 制备 CuSO4·5H2通过加入1 mg的CuSO₄来制备O溶液4·5H2O 溶于 4 mL 的 [0.1 M] Tris（pH 8.5）溶液中。然后向 CuSO₄ 溶液中加入 600 µM Alexa488-叠氮化物溶液（1:40 体积比）和 10 mg/mL 的 L-抗坏血酸钠。4·5H2在将O溶液应用于组织之前。 |
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷 (Edu) | Carbosynth | NE08701 | |
| Alexa-488 叠氮化物 | Thermo Fisher Scientific | A10266 | |
| 抗鸡 Nestin 抗体 | Aves | NES; RRID: AB_2314882 | |
| 抗山羊 DCX 抗体 | Santa Cruz | Cat# SC_8066; RRID: AB_2088494 | |
| 抗小鼠 Tbr2 抗体 | Thermo Fisher Scientific | 14-4875-82; RRID: AB_11042577 | |
| 共聚焦显微镜软件 (Zen Black) | Zeiss Microscopy | Zen 2.3 SP1 FP1 (black) | |
| 五水硫酸铜 (II) | Thermo Fisher Scientific | AC197722500 | |
| 盖玻片 | Denville Scientific | M1100-02 | |
| 带正电荷载玻片 | Denville Scientific | M1021 | |
| 磷酸盐缓冲液 (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Super PAP Pen 4 mm 尖端 | PolySciences | 24230 | |
| Tris 缓冲液 (TBS) | Sigma-Aldrich | T5912 | |
| 吐温 X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 |
