免疫荧光染色用于观察小鼠脑切片中增殖的神经干细胞

摘要

来源:Quintanilla， L. J. 等人。测定成体海马神经前体细胞的电路特异性调节。J. Vis. Exp.（2019 年）

该视频演示了使用 EdU 掺入对脑组织切片中新增殖的神经干细胞进行染色，然后进行免疫荧光以可视化特定蛋白质，从而增强对细胞动力学和增殖的理解。

方案

所有涉及动物样本的程序均已由适当的动物伦理审查委员会审查和批准。

1. 免疫组化

1. 胸苷类似物染色
   1. 将组织切片置于 PBS（磷酸盐缓冲盐水）中，并将 5-8 切片安装在带正电荷的载玻片上，保持从前到后的序列顺序和相同的方向。让组织切片干燥以完全粘附在载玻片上，然后使用疏水笔或 PAP 笔画出边界。
   2. 用透化缓冲液（0.5% TBS（tris 缓冲盐水）-triton）透化切片 20-30 分钟。然后使用 TBS-triton 洗涤切片 2 次，每次 5 分钟。
      注:透化有助于细胞内抗体渗透。透化时间可以根据组织厚度和抗体效率进行调整。或者，可以增加洗涤剂浓度以增加透化效力。然而，应注意不要透化时间过长，因为组织脆性会随着透化时间的延长而增加。
   3. 根据表 1 制备 Edu（5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶）反应溶液。Alexa488-叠氮化物的最终浓度为 1 mL Edu 反应溶液中的 15 μM。
   4. 将切片在 Edu 反应溶液中孵育 30 分钟至 1 小时，然后在 TBS-triton 中洗涤 3 次，每次 5 分钟。完成此步骤后，用铝箔盖住载玻片以保护它们避光。在这个阶段，使用荧光显微镜检查 Edu 反应是否有效。Edu 标记的细胞会在落射荧光显微镜下发出荧光。
2. 安装组织切片方案
   1. 使用在与二抗相同的动物（例如驴血清）中培养的封闭缓冲液封闭安装在步骤 1.1.4 载玻片上的组织切片 30 分钟至 1 小时，然后在 TBS-triton 中洗涤 2 次，每次 5 分钟。
   2. 在封闭步骤中，通过将一抗以 1:200 的比例混合在封闭缓冲液中，制备一抗（即鸡抗巢蛋白）溶液。每张载玻片 250 μL 足以确保组织完全浸没在溶液中。
   3. 封闭洗涤后，将组织切片在一抗溶液中在 RT 中孵育过夜。根据所使用的一抗修改此步骤。
      注意: 如果抗体具有高背景或非特异性结合，则在 4 °C 而不是 RT（室温）下孵育可能会改善结果。如果需要，组织渗透性差的抗体可以孵育 2 天。
   4. 将组织切片在 TBS-triton 中孵育 3 次 5 分钟，以去除多余的一抗。然后，在封闭缓冲溶液中制备的荧光团偶联的二抗（例如，1:200 的 Alexa 647 抗鸡）中孵育组织切片 2 小时。
   5. 将组织切片在 TBS-triton 中孵育 3 次 5 分钟以去除多余的二抗，并在室温下以 1:100 的比例在 PBS 中应用 300 μM DAPI（4′，6-二脒基-2-苯基吲哚）溶液 15 分钟。
   6. 将组织切片在 PBS 中孵育 3 次 5 分钟，以去除多余的 DAPI，并使用棉签或精细的任务擦拭从组织周围去除巴氏笔圆圈。让切片干燥，然后涂抹安装介质和盖玻片。在成像载玻片之前让封固剂干燥。

表 1:用于免疫组织化学的溶液

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 防冻液 乙二醇 150 mL + 蔗糖 150 g + 填充至 500 mL 0.1 M PB 中，用于 500 mL 溶液 柠檬酸盐缓冲液 9 mL 柠檬酸原液 + 41 mL 柠檬酸三钠缓冲液 + 450 mL ddH₂O 柠檬酸原液 [0.1 M] 柠檬酸 21 克/1 升 ddH₂O 柠檬酸三钠原液 [0.1 M] 柠檬酸三钠 29.4 g/1 L ddH₂O Tris 缓冲盐水 -Triton （TBS -Triton） 0.05% 100-x Triton 的 TBS 溶液 透化缓冲液 0.5% 100-x Triton 的 TBS 溶液 阻塞缓冲区 0.33 mL 驴血清，溶于 10 mL TBS-Triton 中 Edu 反应溶液 通过在 4 mL [0.1 M] Tris pH 8.5 溶液中加入 1 mg CuSO₄·5H₂O 制成 CuSO₄·5H₂O 溶液。然后将 1:40 的 600 μM Alexa488-叠氮化物溶液和 10 mg/mL 的 L-Na + 抗坏血酸添加到 CuSO₄·5H₂O 溶液中，然后再将其应用于组织。

材料