利用小胶质细胞作为替代生物传感器评估纳米颗粒对神经元的毒性

摘要

来源：Duffy, C. M. 等., 小胶质细胞作为替代性生物传感器用于评估纳米颗粒的神经毒性。 J. Vis. Exp. (2016).

本视频演示了一种利用小胶质细胞评估纳米颗粒神经毒性的方法。该方法包括用纳米颗粒激活小胶质细胞、过滤条件培养基以分离小胶质细胞来源的促炎性细胞因子，以及利用该条件培养基检测下丘脑神经元的毒性。

方案

1. 小胶质细胞培养的维持

1. 将细胞培养基（杜氏改良伊格尔培养基；DMEM）置于37 °C预热，培养基中需添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素/新霉素（PSN）。
2. 从-80 °C保存处取出第18至25代的BV2小胶质细胞冻存株，在37 °C水浴中快速解冻。
3. 轻柔地将细胞转移至含有10 ml细胞培养基的75 cm² 透气培养瓶中。
4. 将培养瓶置于含5% CO₂ 的37 °C培养箱中孵育。24小时后吸除培养基，更换新鲜培养基。培养细胞至融合度约为70–80%。

2. 细胞计数与接种

1. 在37 °C水浴中预热DMEM和1x-胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）溶液。
2. 吸除细胞培养基，加入500 µl胰蛋白酶溶液，在37 °C孵育2–5分钟。
3. 使用细胞刮刀将细胞从培养瓶中刮下，并重悬于5 ml DMEM中。将细胞悬液经70 µm细胞筛过滤，转入50 ml离心管，重复操作三次。
4. 用血细胞计数板计数细胞，以每孔8,000个细胞的密度接种至黑色侧壁透明底板中，每孔总体积为200 µl DMEM，含10% FBS和1% PSN。将培养板置于37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育24小时。
5. 移除旧的DMEM，更换为200 µl含1% PSN的预热DMEM，以对小胶质细胞进行无血清饥饿处理。将培养板置于37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育24小时。

3. 激活小胶质细胞

1. 在不同的试管中，将银纳米颗粒（AgNPs）（0.01、0.05 或 0.1 µg/ml）和载体/中性对照（柠檬酸钠，0.04 mM）用含 1% PSN 的无血清 DMEM 稀释至最终工作浓度。
2. 从每个孔中移除 100 µl 培养基，并加入 100 µl 相应的处理化合物。
3. 将培养板置于 37 °C、5 % CO₂ 条件下孵育 24 小时。

4. 过滤条件培养基

1. 从每个孔中收集 200 µl 培养基上清液，转移至含有收集管（容量为 1.5 至 2 ml）的滤膜装置中（分子量截留值为 10 kDa）。
2. 在室温下以 14,000 × g 离心 15 分钟。
3. 弃去穿滤液（含有颗粒的上清液），将滤膜倒置放入新的收集管中。
4. 在室温下以 1,000 × g 离心 2 分钟。
   注意： 所得滤过培养基（含分泌的细胞因子）浓度被浓缩了六倍。
5. 用新鲜的 DMEM（补充 10% FBS 和 1% PSN）将浓缩液体积补至 400 µl，并置于冰上保存。

5. 下丘脑细胞培养的维持

1. 将添加了10% FBS和1% PSN的DMEM细胞培养基预热至37 °C。
2. 取一支保存于-80 °C、传代数为18–25代的下丘脑（mHypo-A1/2）细胞冻存管，在37 °C水浴中快速解冻细胞。
3. 轻柔地将细胞转移至含有10 ml细胞培养基的75 cm² 透气培养瓶中。
4. 将培养瓶置于含5% CO₂ 的37 °C培养箱中孵育。24小时后吸除培养基，更换新鲜培养基。培养细胞至其融合度达到约70–80%。

6. 确定下丘脑细胞毒性

1. 将DMEM和1×胰蛋白酶-EDTA溶液在37 °C水浴中预热。
2. 吸除下丘脑细胞的培养基，加入500 µl胰蛋白酶溶液。在37 °C孵育2–5分钟。如上文步骤2所述，使用细胞刮刀从培养瓶中收集细胞。
3. 使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将下丘脑细胞以每孔5,000个细胞的密度接种于黑色壁透明底板中，每孔终体积为200 µl DMEM，其中添加10% FBS和1% PSN，于37 °C、5% CO₂ 条件下孵育过夜。
4. 使用多通道移液器吸除100 µl旧培养基，加入100 µl过滤后的浓缩条件培养基，使其终浓度为1×。
5. 将培养板置于37 °C、5% CO₂ 条件下孵育24小时。
6. 加入22 µl刃天青试剂，于37 °C、5% CO₂ 条件下继续孵育20分钟。
7. 使用多功能酶标仪检测荧光（激发波长560 nm，发射波长590 nm），以评估细胞活力。结果以相对荧光单位（RFU）表示。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞/试剂
小鼠小胶质细胞系 (BV2)	Interlab 细胞库 (Genoa, 意大利)	ATL03001
成年小鼠下丘脑细胞系 mHypoA-1/2	Cellutions Biosystems 公司	CLU172
杜尔贝科改良伊格尔培养基	Invitrogen	10313-039
胎牛血清	PAA Labs	A15-751
青霉素/链霉素/新霉素	Thermo Fisher Scientific	15640-055
胰蛋白酶-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25200056
银纳米颗粒 (20 nm)	Sigma-Aldrich	730793
PrestoBlue 细胞活力检测试剂	Invitrogen	A13262
小鼠 TNF-α ELISA Max Delux	Biolegend	430904
脂多糖	Sigma-Aldrich	L4391
柠檬酸钠	Sigma-Aldrich	S4641
仪器设备
96 孔光学底板，黑色聚苯乙烯，细胞培养处理，带盖，无菌	Thermo Fisher Scientific	165305
Amicon Ultra-0.5 离心过滤单元，含 Ultracel-10 膜	EMD Millipore	UFC501008
SpectraMax M5 多功能微孔板读板仪	Molecular Devices	M5
Falcon 50 mL 圆锥形离心管	Corning, Inc	14-432-22
Falcon 细胞滤筛 70 μm	Corning, Inc	08-771-2
台式离心机 5430	Eppendorf	22620560