机械损伤 果蝇 幼虫节段神经以诱导神经退行性变

摘要

来源：Danella, E. B. 等，et al。一种研究果蝇运动神经元退化的简单神经机械损伤方法。J. Vis. Exp. (2017)。

视频展示了在果蝇幼虫节段神经中诱导神经退行性变的过程 通过 机械损伤。使用镊子夹住麻醉后幼虫的腹侧角质层，以损伤其节段神经。将受伤的幼虫继续饲养在食物中，使损伤导致神经中的运动神经元发生退化，进而破坏其神经肌肉接头（NMJs）。

方案

1. 试剂与仪器的准备

1. 配制1×解剖缓冲液（70 mM NaCl、5 mM KCl、0.02 mM CaCl₂、20 mM MgCl₂、10 mM NaHCO₃、115 mM蔗糖、5 mM海藻糖、5 mM羟乙基哌嗪乙磺酸[HEPES]；pH 7.2）。
2. 配制1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）。
3. 使用含0.01% Triton X-100的1× PBS配制1× PBT。
4. 制备果汁琼脂平板。简要步骤如下：将30 g琼脂加入700 mL H₂O中，高压灭菌。将0.5 g对羟基苯甲酸甲酯溶解于10 mL乙醇中，然后加入300 mL果汁浓缩液（葡萄或苹果）中。将浓缩液混入已灭菌的琼脂溶液中，并倒入10 mm × 35 mm培养皿的皿盖中。
   注意：葡萄琼脂预混粉也可从多家公司购买（参见材料表）。
5. 准备5号镊子，用于对幼虫进行机械损伤。
6. 使用标准的基于CO₂的果蝇麻醉装置。

2. 选择果蝇幼虫

1. 取一个装有在 25 °C 下培养的游走期三龄幼虫的果蝇小瓶或瓶子。
2. 根据形态特征挑选十只二龄或三龄幼虫个体。三龄幼虫可通过前端分枝的气门识别，而二龄幼虫体型较小，前端气门呈棒状。
   注意：幼虫阶段也可通过时间判断。在 25 °C 条件下，二龄幼虫约在孵化后 48 小时出现，三龄幼虫则在约 24 小时后蜕皮形成。若需研究神经肌肉接头处的神经退行性变化，则需对二龄幼虫进行损伤处理。

3. 准备果蝇幼虫以进行机械损伤

1. 使用镊子或画笔小心夹取单个幼虫，注意不要以任何方式挤压幼虫。
2. 将十只幼虫直接放入含有冷的1× PBS或解剖缓冲液的玻璃培养皿中，以去除食物残渣并减缓幼虫活动。

4. 果蝇幼虫的机械损伤与处理

1. 将每只幼虫放置在 CO₂ 麻醉装置上。
2. 在解剖显微镜下，小心地将每只幼虫翻转至背侧，以便透过体壁观察节段神经。
3. 从口钩开始，将5号镊子置于幼虫体长约1/2至2/3的位置。定位后，用5号镊子夹住包含节段神经的大约1/3腹侧体壁。​
   1. 为确保幼虫节段神经受损，需施加足够力量压碎节段神经，同时保持体壁完整。为确定合适的力度，可先压碎10只幼虫，并确保5小时后死亡率低于50%。
4. 损伤后，小心将幼虫转移至含有约0.5 g酵母糊的果汁琼脂平板上。将每只幼虫的前端置于酵母糊上，以保证其在运动功能受损的情况下仍能持续进食。
   注意：为确认幼虫节段神经已受损，可在转移至琼脂平板后观察其运动功能是否受损。受损幼虫在损伤部位后方基本瘫痪，但仍可活动口钩并进食。损伤后动物死亡率较高，因此建议损伤的动物数量比实验所需多20–50%。
5. 将含有酵母糊和10只受损幼虫的琼脂平板放入一个空的100 × 15 mm培养皿底部。用一张湿润的纸巾覆盖该培养皿（其中已放置了受损幼虫的琼脂平板），注意纸巾不得接触幼虫或琼脂平板。将此培养皿置于较大的密闭容器中，在室温（RT）下保存。
6. 在损伤后指定时间点（6、12或24小时）取出幼虫进行解剖。
   注意：若需观察损伤对轴突细胞骨架的即时影响，可在损伤后立即解剖幼虫；若需观察轴突运输缺陷，可在损伤后约6小时解剖；损伤约12小时后可观察到泛素化蛋白的积聚；损伤24小时后可在神经肌肉接头处观察到运动神经元的退变。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
显微解剖剪	Fine Science Tools	15000-08
Dumont #3 镊子	Fine Science Tools	11231-30	有些人偏好3号，有些人则偏好5号
Dumont #5 镊子	Fine Science Tools	11251-30	有些人偏好3号，有些人则偏好5号
CO2 气瓶	Tech Air	UN 1013	可购买不同规格的气瓶
CO2 麻醉装置	Genesee Scientific	59-114
不锈钢大头针，0.1号	Fine Science Tools	26002-10
SylGard 184 硅胶弹性体基料与固化剂	Dow Corning	3097358-1004	用于浇注解剖培养皿
解剖体视显微镜	AmScope	SM-1BZ
光源	AmScope	HL150-AY-220V
果蝇葡萄汁琼脂预混粉	Genesee Scientific	47-102
显微镜载玻片	Genesee Scientific	29-101
玻璃盖玻片	Fisher Scientific	12-545-87
Thermo Scientific Nalgene 工具箱	Fisher Scientific	03-484C	用于构建幼虫恢复用的保湿室