利用荧光染料检测实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型中血脑屏障的破坏

摘要

来源：Tietz, S. M.，等，在实验性自身免疫性脑脊髓炎中体内可视化神经血管单元的内皮和胶质屏障损伤。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频演示了在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠模型中评估血脑屏障破坏的实验方法。通过眼眶后注射不同分子量的荧光染料，使其在脑部血管中循环。较小分子量的染料可渗漏进入脑组织，而较大分子量的染料仅在血脑屏障严重受损时才能进入，从而反映屏障损伤的程度。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 体内通透性检测

1. 溶液的制备：
   1. 配制葡聚糖储备液：将10 mg的10 kDa Dextran Alexa Fluor 488以及10 mg的3 kDa Dextran Texas Red分别溶解于500 µL的0.9%氯化钠溶液中（终浓度为20 mg/mL）。
   2. 配制葡聚糖工作液：在注射前，取55 µL的10 kDa Dextran Alexa Fluor 488储备液（20 mg/mL）滴加至一片封口膜上，再加入55 µL的3 kDa Dextran Texas Red储备液（20 mg/mL），混匀后吸取100 µL转移至一次性微量注射器中（终浓度为2 mg/100 µL）。
   3. 配制10%甲醛（多聚甲醛，PFA）储备液：在洁净玻璃烧杯中加入10 g高纯度PFA粉末、100 mL PBS和200 µL 1N氢氧化钠（NaOH），在磁力搅拌器上加热并持续搅拌，精确控温至56 °C。保持56 °C持续30分钟，直至PFA完全溶解。冷却至室温后，调节pH至7.4，经滤纸过滤。储存于—20 °C。该储备液可用磷酸盐缓冲液（PBS）进一步稀释使用。
2. 使用异氟烷对健康的C57BL/6小鼠或患有实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的C57BL/6小鼠进行短暂麻醉（麻醉时间约1分钟）。采用自动化系统（小鼠先在诱导舱中暴露于4.5%异氟烷氧气混合气体，随后转移至面罩并维持2.1%异氟烷）。
3. 将麻醉后的小鼠侧卧置于操作台上，在其苏醒前经静脉途径（如眶后静脉）注射100 µL荧光示踪剂。
4. 立即移除面罩，确保小鼠在短暂麻醉后完全清醒并可自由活动。让示踪剂循环15分钟。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
葡聚糖 Alexa Fluor 488（10,000 MW）	例如 Molecular probes	D22910	在 -20 °C 下保存；避光
葡聚糖 Texas Red（3000 MW）	Invitrogen	D3328	在 -20 °C 下保存；避光
维持饲料	例如 PROVIMI KLIBA SA	3436
多聚甲醛	Merck	30525-89-4
0.9 % NaCl	B. Braun	3535789
封口膜，例如 Parafilm M	例如 Sigma-Aldrich	P7793
1 ml 注射器	例如 PRIMO	62.1002