小鼠颅面组织的免疫染色

摘要

来源：Yang, J., 等，小鼠颅面组织及未脱钙骨的组织制备与免疫染色。J. Vis. Exp. (2019)

本视频演示了使用荧光显微镜对小鼠胚胎颅面组织冷冻切片进行免疫荧光染色，以检测核标记物的表达，并评估细胞增殖和信号通路活性。

方案

免责声明： 所有涉及动物样本的操作均经过相应的动物伦理审查委员会审核并批准。 

1. 免疫荧光染色

1. 从 -80 °C 取出载玻片，在室温下放置 1 小时以晾干组织切片。用 0.1% PBST（0.1% 聚乙二醇叔辛基苯基醚溶于 PBS 中；见材料表）清洗载玻片三次，每次 5 分钟，以去除 OCT 包埋剂并通透组织切片。
2. 可选步骤：进行抗原修复（可选）。
   1. 将柠檬酸盐缓冲液（10 mM 柠檬酸钠，pH 6）置于染色缸中，使用蒸锅或水浴加热至 95–100 °C。将载玻片浸入柠檬酸盐缓冲液中，孵育 10 分钟。
   2. 将染色缸从蒸锅或水浴中取出，于室温下冷却载玻片 20 分钟或更长时间。
      注意：作为替代方案，可使用 Tris-EDTA 缓冲液（10 mM Tris 碱，1 mM EDTA，0.05% Tween 20，pH 9.0）或 EDTA 缓冲液（1 mM EDTA，0.05% Tween 20，pH 8.0）进行热诱导抗原修复。除热蒸气外，也可使用压力锅、微波炉或水浴进行热诱导抗原修复。另一种替代方法是使用胰蛋白酶或胃蛋白酶进行酶诱导抗原修复。需优化酶的浓度和处理时间，以避免损伤组织切片。应针对每种抗体/抗原组合优化抗原修复方法。
3. 每张载玻片加入 200 μL 封闭液（5% 驴血清用 0.1% PBST 稀释），室温孵育 30 分钟，然后去除封闭液，无需洗涤。
4. 每张载玻片加入 100 μL 用封闭液稀释的一抗或多种一抗，室温孵育 1 小时，或 4 °C 过夜。随后在室温下用 PBS 洗涤载玻片三次，每次 10 分钟。
5. 每张载玻片加入 100 μL 用封闭液稀释的二抗，室温孵育 1 小时。在室温下用 PBS 洗涤载玻片三次，每次 10 分钟。操作过程中需避光。
6. 封片。
   1. 在载玻片上滴加两滴含 DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）的抗荧光淬灭封片剂，然后加盖盖玻片。
   2. 置于 4 °C 避光保存，待成像时取出。
      注意：作为替代方案，可先在室温下用 PBS 1:2,000 稀释的 DAPI 或 Hoechst 33324 染料对细胞核进行染色，然后用甘油封片。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Alexa fluor 488-山羊抗兔二抗	Invitrogen	A-11034
含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂	Invitrogen	P36931
牛血清白蛋白	Sigma	A2153
盖玻片	Fisher Brand	12-545-E
冷冻切片机	Leica	CM1850
EDTA	Sigma	E6758
荧光显微镜	Olympus	BX51
载玻片	Fisher Brand	12-550-15
OCT 包埋剂	Fisher Healthcare	23-730-571
多聚甲醛（PFA）	Sigma	P6148
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma	P4417
聚乙二醇叔辛基苯基醚	Sigma	T9284	Triton X-100
兔抗 Ki67 抗体	Cell Signaling Technology	9129	批号#:3; RRID:AB_2687446
兔抗 pSmad1/5/9 抗体	Cell Signaling Technology	13820	批号#:3; RRID:AB_2493181
柠檬酸钠	Sigma	1613859
Tris	Sigma	10708976001