使用荧光成像可视化神经元中的囊泡运动

Abstract

来源:Tsuruta， F. 等人 使用荧光探针定量培养神经元中的内体和溶酶体运动性。J. Vis. Exp. （2017 年）。

该视频演示了如何用特异性荧光蛋白标记神经元囊泡以可视化其运动。首先，将编码荧光蛋白的质粒与转染试剂一起孵育，然后引入神经元培养物中。随后，获取并分析神经元的图像以跟踪囊泡的运动。

Protocol

1. 囊泡运动成像

1. 准备将标记每种囊泡的质粒。例如，将 EGFP-Rab5 用于早期内体，将 EGFP-Rab7 用于晚期内体，将 LAMP-EGFP 用于溶酶体，将 EGFP-LC3 用于自噬体><。 注意:这些质粒可应 tsuruta.fuminori.fn@u.tsukuba.ac.jp 的要求提供。通常，可以使用转染试剂用这些质粒转染 3 -5 天的体外（Division 或 DIV）神经元。
2. 通过移液将 4.0 μg 质粒与 200 μL 无血清培养基混合。在单独的试管中，在 200 μL 无血清培养基中稀释 8 μL 转染试剂（参见材料表）。在室温 （RT） 下孵育 5 分钟。
3. 通过移液将质粒溶液和转染 Regent 溶液在步骤 1.2 中混合。在 RT 下孵育 20 分钟。
4. 将无血清培养基和步骤 1.3 中的 400 μL 质粒溶液添加到每个含有皮质神经元脑皮质培养基的包被玻璃底培养皿中。将神经元在 37 °C 下在 5% CO₂ 培养箱中孵育 30 分钟。用 2 mL 脑皮质培养基替换培养基。将神经元在 37 °C 下在 5% CO₂ 培养箱中孵育 1-2 天><。 注意:制备一种大脑皮质培养基，由补充有 1x B-27 补充剂、2 mM L-谷氨酰胺和 100 U/mL 青霉素-链霉素的神经元基础培养基组成。
5. 转染 1 - 2 天后，选择转染细胞进行图像采集。
   注意:小于 7 DIV 的早产神经元倾向于表现出动态囊泡运动。选择适度表达荧光探针的神经元，因为当选择高表达神经元时无法获得清晰的图像。此外，选择典型的神经元形状，例如锥体神经元，它具有长轴突和复杂的树突，以便于识别轴突和树突（参见图 1A）。
6. 使用延时成像系统采集图像:对于成像，使用配备电荷耦合器件 （CCD） 相机的荧光显微镜，该相机配备 40 倍 Plan Apo 0.95NA 或 100 倍 Plan Apo VC NA1.4 物镜。使用孵育系统将温度控制在 37 °C。在图像采集软件控制的 100 秒周期内以一帧/5 秒的速度采集神经元图像。或者，以较短的间隔和较长的时间段采集图像，例如在 300 秒的时间内每 2 秒采集一帧><。 注意:有多种应用程序可用于拍摄连续图像，其中许多应用程序都适用于这种方法。因此，不建议使用特定的应用程序;相反，每个研究人员都应该使用任何可用的应用程序。

2. 图像分析

1. 使用手动跟踪在 ImageJ 软件中打开所有连续图像。
   注意:迄今为止，手动跟踪已广泛用于跟踪实验。手动跟踪由 Fabrice Cordelières 博士开发。详细的书面说明可在线获取。对于分析，使用足够数量的图像可以提高成像数据的质量。建议使用 20 张以上的图像。
2. 要合并连续图像，请选择→ → 。点击。
3. 选择 → ;将弹出一个跟踪窗口。
4. 单击 复选框并在 参数部分定义跟踪参数。
   注意:可以设置多个参数，包括时间间隔、x/y 校准、z 校准、用于居中的搜索方块大小、点大小、线宽和字体大小。在这种简化的测定中，定义了时间间隔和 x/y 校准。在其他实验情况下，可能还需要定义其他参数。此处使用的参数如下:为 5 秒，40 倍平场消色差 0.95NA 物镜为 0.26642 μm，100 倍平场消脂消色差 VC NA1.4 物镜为 0.10657 μm。
5. 定义参数后，单击 开始新轨道。
6. 确定感兴趣的囊泡（例如，图 1A（右图）中蓝色和红色箭头指示的囊泡）后，单击序列图像中信号的中心以记录 xy 坐标。记录的 xy 坐标、距离和速度的结果将显示在新窗口中。
   注意:在溶酶体的情况下，通常在神经元中观察到大而明亮的荧光信号（例如，图 1A（右图），橙色箭头）。这些信号偶尔表现出积聚的囊泡或病理性静脉曲张，因此应避免使用这些信号来量化运动。
7. 重复步骤 2.6 以从所有连续图像中收集囊泡的 xy 坐标;选择参考点后，每个图像都会自动前进到连续的图像。
8. 将这些数据导出到新表（例如，电子表格）。使用适当的软件创建合适的图表（参见材料表）。
   注意:要分析数据，请选择该列，将此列的所有值相加，并以条形图的形式显示运动距离，如图 1B 所示。此外，重复此步骤，计算总运动距离的平均值，并显示为条形图，如图 1C 所示。用于创建条形图和波形数据的软件如材料表中所示。

Results

图 1:神经元树突中的溶酶体运动。（A） 用 LAMP-EGFP 质粒转染小鼠皮层神经元 （4 DIV） 2 天。该图像显示了树突中含有 LAMP-EGFP 的囊泡的运动性。插图显示了 LAMP-EGFP 阳性囊泡的延时图像。红色箭头表示移动的囊泡，蓝色箭头表示静止的囊泡。如上所述，橙色箭头表示较大的荧光信号。比例尺 = 20 μm。（B） 图 A 中 LAMP-EGFP 阳性囊泡的时间依赖性 x 轴位置。标记为 （b） 的红色圆圈中的囊泡在移动，标记为 （a） 的蓝色圆圈中的囊泡正在静止。比例尺:5 μm（左）。条形图表示 LAMP-EGFP 移动的总距离（右）。（C） 条形图表示含 LAMP-EGFP 的囊泡的平均运动距离。（n = 5，均值±均值 [SEM] 的标准误差，**p <0.01 通过学生 t 检验）。

Materials