使用荧光成像技术观察神经元中囊泡的运动性

摘要

来源：Tsuruta, F.，等。利用荧光探针定量培养神经元中内体和溶酶体的运动性。J. Vis. Exp. (2017)。

本视频展示了如何用特定的荧光蛋白标记神经元囊泡，以观察其运动。首先，将编码荧光蛋白的质粒与转染试剂孵育，然后导入神经元培养物中。随后，采集并分析神经元的图像，以追踪囊泡的运动。

方案

1. 成像囊泡运动性

1. 准备用于标记每种类型囊泡的质粒。例如，使用 EGFP-Rab5 标记早期内体，EGFP-Rab7 标记晚期内体，LAMP-EGFP 标记溶酶体，EGFP-LC3 标记自噬体。
   注意： 这些质粒可向 tsuruta.fuminori.fn@u.tsukuba.ac.jp 提出申请获取。通常可在体外培养 3–5 天（DIV）的神经元中使用转染试剂转染这些质粒。
2. 用移液器将 4.0 µg 质粒与 200 µL 无血清培养基混合。在另一管中，将 8 µL 转染试剂（见材料表）稀释于 200 µL 无血清培养基中。室温（RT）孵育 5 分钟。
3. 用移液器将步骤 1.2 中的质粒溶液与转染试剂溶液混合。室温孵育 20 分钟。
4. 将无血清培养基和 400 µL 来自步骤 1.3 的质粒溶液加入每个含有皮层神经元的包被玻底培养皿中，再加入脑皮层培养基。将神经元在 37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育 30 分钟。随后更换为 2 mL 脑皮层培养基。继续在 37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育 1–2 天。
   注意： 脑皮层培养基的配制成分为：神经元基础培养基添加 1× B-27 添加剂、2 mM L-谷氨酰胺和 100 U/mL 青霉素-链霉素。
5. 转染后 1–2 天，选择已转染的细胞进行图像采集。
   注意： 体外培养小于 7 天（DIV）的未成熟神经元通常表现出较强的囊泡动态运动。应选择荧光探针表达水平适中的神经元，因为高表达的神经元难以获得清晰图像。此外，应选择典型神经元形态（如锥体神经元），其具有较长的轴突和复杂的树突，便于轴突与树突的识别（见图 1A）。
6. 使用延时成像系统进行图像采集：成像时采用配备电荷耦合器件（CCD）相机的荧光显微镜，物镜选用 40X Plan Apo 0.95NA 或 100X Plan Apo VC NA1.4。通过培养系统控制环境温度为 37 °C。由图像采集软件控制，以每 5 秒一帧的速度连续采集 100 秒内的图像。也可根据需要缩短采集间隔并延长采集时间，例如每 2 秒一帧，持续 300 秒。
   注意： 可用于连续成像的软件种类繁多，多数均适用于本方法。因此不特别推荐某一款软件，研究人员可根据实际情况选用可用的软件。

2. 图像分析

1. 使用 ImageJ 软件中的 Manual Tracking 功能打开所有连续图像。
   注意：截至目前，Manual Tracking 已广泛应用于追踪实验中。该插件由 Dr. Fabrice Cordelières 开发，详细的书面操作说明可在线获取。为提高成像数据的分析质量，建议使用超过 20 张图像。
2. 为合并连续图像，请选择→ → ，然后点击 。
3. 选择 → ；此时将弹出一个追踪窗口。
4. 点击 复选框，并在参数部分定义追踪参数。
   注意：可设置多个参数，包括时间间隔、x/y 校准、z 校准、中心定位搜索方框大小、点大小、线宽和字体大小。在此简化实验中，仅定义了时间间隔和 x/y 校准参数；但在其他实验条件下，可能还需定义其他参数。本实验所用参数如下： 为 5 秒， 为 40X Plan Apo 0.95NA 物镜时是 0.26642 µm，或为 100X Plan Apo VC NA1.4 物镜时是 0.10657 µm。
5. 参数设定完成后，点击 以开始新建一条轨迹。
6. 确定目标囊泡（例如图 1A（右侧面板）中蓝色和红色箭头所示的囊泡）后，在连续图像中点击信号中心位置，以记录 xy 坐标。记录所得的 xy 坐标、移动距离和速度结果将显示在一个新窗口中。
   注意：在溶酶体实验中，神经元中常可观察到较大的明亮荧光信号（例如图 1A（右侧面板）中的橙色箭头所示）。这些信号可能代表聚集的囊泡或病理性膨大结构，因此在量化运动性时应予以避免。
7. 重复步骤 2.6，采集所有连续图像中囊泡的 xy 坐标；选定参考点后，每张图像将自动跳转至下一张。
8. 将这些数据导出至新表格（例如电子表格），并使用适当的软件生成合适的图表（参见材料表）。
   注意：为分析数据，选择某一列，对该列所有数值求和，并以柱状图形式展示运动距离，如图 1B 所示。此外，重复此步骤，计算总运动距离的平均值，并以柱状图形式展示，如图 1C 所示。材料表中列出了用于生成柱状图和波形数据的软件。

结果

图 1：神经元树突中溶酶体的运动性。 （A）小鼠皮层神经元（体外培养 4 天）转染 LAMP-EGFP 质粒并表达 2 天。该图像显示了树突中含 LAMP-EGFP 的囊泡的运动情况。插图为 LAMP-EGFP 阳性囊泡的时间序列图像。红色箭头指示一个移动的囊泡，蓝色箭头指示一个静止的囊泡。橙色箭头指示如上所述的较强荧光信号。比例尺 = 20 µm。（B）来自图 A 的 LAMP-EGFP 阳性囊泡随时间变化的 x 轴位置。红色圆圈标记的囊泡（b）处于运动状态，蓝色圆圈标记的囊泡（a）处于静止状态。比例尺：5 µm（左）。柱状图表示 LAMP-EGFP 囊泡运动的总距离（右）。（C）柱状图表示含 LAMP-EGFP 的囊...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Neurobasal 培养基	Thermo Fisher	21103-049
Opti-MEM	Thermo Fisher	31985070	无血清培养基
青霉素-链霉素	Thermo Fisher	15140122
L-谷氨酰胺	Thermo Fisher	25030081
B-27 添加剂	Thermo Fisher	17504044
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐	Sigma	P7280
聚-L-鸟氨酸	Sigma	P4957
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher	11668027	转染试剂
Polyethyleneimine "Max"	polysciences	24765	转染试剂。可作为 Lipofectamine 2000 的替代品，使用 0.1 mg/mL 的 Polyethyleneimine 溶于无菌水中。但其转染效率较低且毒性较高。
BIOREVO BZ-9000	Keyence	NA
培养系统 INUG2-K13	Tokay Hit	NA
GraphPad Prism 版本 6.0	GraphPad Software	NA
Excel 版本 15	Microsoft	NA
ImageJ 版本 1.47	NA	NA