使用免疫荧光法定量小鼠脑内突触前蛋白的分布

本文内容

摘要

本视频演示了对小鼠脑切片进行免疫荧光染色，以定量分析特定突触前蛋白的分布情况。该过程包括封闭非特异性结合位点，依次加入靶蛋白的一抗和参考标记物的一抗，随后进行二抗标记以及细胞核复染。参考标记物可提供一致的基准信号，确保定量结果的准确性，通过共聚焦显微镜对突触前蛋白在不同脑区的分布进行分析。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 免疫荧光

配制溶液，包括封闭缓冲液、抗体缓冲液、洗涤缓冲液1和洗涤缓冲液2（见表1）。
用磷酸盐缓冲液（PB）冲洗切片一次，以去除多余的冷冻切片包埋剂（OCT）。
1. 使用塑料移液器将溶液吸出，注意不要吸入脑切片。用1000 µL移液器向每孔加入250 µL新鲜PB。
  注意：切片不应干燥，因此应逐孔彻底移除和添加液体。
用塑料移液器吸去PB，每孔用1000 µL移液器加入250 µL封闭缓冲液。在摇床上室温（RT）孵育3小时。
在孵育期间，于反应管中用抗体缓冲液稀释一抗。每孔使用250 µL抗体缓冲液，并用2 µL移液器直接将适量抗体加入溶液中（见表2）。通过轻柔吹打数次混匀溶液，随后短暂涡旋以确保充分混合。
注意：为确定背景荧光，应同时进行不加一抗的染色对照。为此，按照本方案将切片在不含一抗的抗体溶液中孵育。
孵育结束后，用塑料移液器吸去封闭缓冲液，每孔加入含一抗的抗体溶液250 µL。在4 °C摇床上避光孵育过夜。
次日，在摇床上用洗....

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材料

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