来源：Wallrafen, R.，等。利用免疫荧光法定量小鼠脑内突触蛋白的异质性分布。J. Vis. Exp. (2019)。
本视频演示了对小鼠脑切片进行免疫荧光染色，以定量分析特定突触前蛋白的分布情况。该过程包括封闭非特异性结合位点，依次加入靶蛋白的一抗和参考标记物的一抗，随后进行二抗标记以及细胞核复染。参考标记物可提供一致的基准信号，确保定量结果的准确性，通过共聚焦显微镜对突触前蛋白在不同脑区的分布进行分析。
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方法文章
使用免疫荧光法定量小鼠脑内突触前蛋白的分布
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。
1. 免疫荧光
- 配制溶液，包括封闭缓冲液、抗体缓冲液、洗涤缓冲液1和洗涤缓冲液2（见表1）。
- 用磷酸盐缓冲液（PB）冲洗切片一次，以去除多余的冷冻切片包埋剂（OCT）。
- 使用塑料移液器将溶液吸出，注意不要吸入脑切片。用1000 µL移液器向每孔加入250 µL新鲜PB。
注意：切片不应干燥，因此应逐孔彻底移除和添加液体。
- 使用塑料移液器将溶液吸出，注意不要吸入脑切片。用1000 µL移液器向每孔加入250 µL新鲜PB。
- 用塑料移液器吸去PB，每孔用1000 µL移液器加入250 µL封闭缓冲液。在摇床上室温（RT）孵育3小时。
- 在孵育期间，于反应管中用抗体缓冲液稀释一抗。每孔使用250 µL抗体缓冲液，并用2 µL移液器直接将适量抗体加入溶液中（见表2）。通过轻柔吹打数次混匀溶液，随后短暂涡旋以确保充分混合。
注意：为确定背景荧光，应同时进行不加一抗的染色对照。为此，按照本方案将切片在不含一抗的抗体溶液中孵育。 - 孵育结束后，用塑料移液器吸去封闭缓冲液，每孔加入含一抗的抗体溶液250 µL。在4 °C摇床上避光孵育过夜。
- 次日，在摇床上用洗涤缓冲液1于室温洗涤切片，每次10分钟，共洗3次。
- 用塑料移液器吸去液体，每孔加入300 µL洗涤缓冲液1。室温孵育10分钟，重复3次。
- 在洗涤过程中，于反应管中用抗体缓冲液稀释荧光标记的二抗。每孔使用250 µL抗体缓冲液，并用2 µL移液器直接将适量二抗加入溶液中（见表2）。通过轻柔吹打数次混匀溶液，随后短暂涡旋以确保充分混合。
注意：由于抗体对光敏感，自此步骤起所有操作均需在避光条件下进行。 - 洗涤结束后，用塑料移液器吸去洗涤缓冲液1，每孔加入含二抗的抗体溶液250 µL。在室温避光条件下孵育90分钟。
- 用洗涤缓冲液2在室温下洗涤切片，每次10分钟，共洗3次。
- 在洗涤过程中，将4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）用0.1 M PB按1:2000比例稀释。
- 用塑料移液器吸去洗涤缓冲液2，每孔加入250 µL DAPI溶液。在摇床上室温孵育5分钟。
- 用塑料移液器吸去DAPI溶液，每孔用1000 µL移液器加入500 µL 0.1 M PB。
- 将切片封片于显微镜载玻片上。
- 将显微镜载玻片置于体视显微镜下。用细毛刷在载玻片上分别滴加三滴0.1 M PB，每滴放置一个切片。
- 用细毛刷将切片在载玻片上展平并调整方向。
- 当所有切片均正确放置后，用纸巾吸去多余PB，并小心擦干载玻片。
注意：避免脑切片完全干燥。 - 在载玻片上加入80 µL封片介质。小心地将盖玻片缓缓放下，使脑切片被完全封埋。
- 将载玻片置于通风橱中干燥1–2小时（加盖以避免光照），随后存放于载玻片盒中，4 °C保存。
注意：本方案可在此处暂停。
2. 成像
- 包埋介质完全硬化后，将载玻片置于共聚焦显微镜下。
注意：使用落射荧光显微镜结合去卷积软件应可获得相似的图像质量。 - 通过增加或减少每个通道的激光强度来调整激光设置，使极少像素过曝，以确保灰度值的最大分布。
- 采集脑切片不同通道的虚拟组织图像。
- 在成像软件中选择拼图（Tiles）选项，并使用拼图区域设置（Tile Region Setup）手动勾画脑切片区域。
- 在拼图区域内分布多个支撑点，并通过点击验证拼图区域/位置（Verify Tile Regions/Positions…）调整各支撑点的焦距。
- 根据所需分辨率和最终图像的文件大小，在采集模式（Acquisition Mode）中调整设置，然后开始扫描。
- 扫描完成后，使用图像拼接（Stitching）功能处理虚拟组织图像，并通过图像导出（Image Export）功能将文件导出为 .tif 格式。
3. 基于计算机的分析
- 通过点击 文件| 打开，将一幅图像的所有单通道加载到 FIJI 中。
- 使用 自由手选择 工具，在 DAPI 通道中勾勒出一个半脑区域。通过点击 编辑| 选择| 创建掩膜，生成该选区的掩膜。
- 通过点击 分析| 测量，确定各单通道（Mover 和突触素）的平均荧光强度。
注意：请确保选择不同的通道，以分别获取每个通道的平均荧光强度值。 - 将各单通道的平均荧光强度值复制到电子表格中。
- 使用 自由手选择 工具勾勒出目标区域，参照小鼠脑图谱，在该区域内测定各单通道的平均荧光强度。
- 对所有半脑及所有感兴趣区域重复步骤 3.1–3.5。
注意：应分别测定每个半脑的数值，以便后续将感兴趣区域的数值与同侧半脑的数值进行比较（见步骤 4.2）。
4. 数据处理
- 如果背景荧光较高，可能需要进行背景扣除。为此，测定未使用针对参考蛋白（此处为突触素）的一抗处理的切片的平均荧光强度，并从所有脑区和半脑测得的数值中减去该值。
- 当确定了每个半脑及每个感兴趣区域各单通道的平均荧光强度后（见表3），通过将Mover的数值除以突触素的数值来计算Mover与突触素的比值（表3中黄色部分）。对每个半脑和每个感兴趣区域分别进行此计算。
- 将某一感兴趣区域所得比值除以对应半脑的比值（表3中橙色部分），以确定该感兴趣区域与半脑的比值。
- 为确定Mover的相对丰度，将步骤4.2中获得的比值转换为百分比，即计算其与1的偏差程度（表3中红色部分）。例如，比值为1.25时，表示Mover的相对丰度高于平均水平25%；比值为0.75时，表示Mover的相对丰度低于平均水平25%。
表1：本方案中使用的溶液。
| 固定液（500 mL） | |
| 加入20 g多聚甲醛（终浓度：4%） 50 mL 10x PBS 储存液（终浓度：1x） 450 mL 双蒸水 H2O，用 NaOH 调节 pH 至 7.4 注意：为使多聚甲醛溶解于 PBS 中，需加热溶液。加热温度不得超过 70 oC，因多聚甲醛在高于 70 oC 时会分解。 警示：多聚甲醛具有毒性，可能致癌且有致畸性。操作时需佩戴手套，并在通风橱中进行。避免摄入。 | |
| 0.1 M 磷酸缓冲液（PB，1 L） | |
| 储存液 X 35.61 g Na2HPO4·2H2O 溶于 1 L 双蒸水 H2O | 储存液 Y 27.60 g NaH2PO4·2H2O 溶于 1 L 双蒸水 H2O |
| 混合 385 mL 储存液 X 115 mL 储存液 Y 500 mL 双蒸水 H2O | |
| 封闭缓冲液（50 mL） | |
| 混合 1.25 mL 正常山羊血清（终浓度：2.5%） 1.25 mL 正常驴血清（终浓度：2.5%） 0.5 mL 非离子型表面活性剂（Triton-X100，终浓度：1%） 47 mL 0.1 M PB | |
| 抗体稀释缓冲液（50 mL） | |
| 混合 0.25 mL 正常山羊血清（终浓度：0.5%） 0.25 mL 正常驴血清（终浓度：0.5%） 0.1 mL 非离子型表面活性剂（终浓度：0.2%） 49.4 mL 0.1 M PB | |
| 洗涤缓冲液 1（50 mL） | |
| 混合 1 mL 正常山羊血清（终浓度：2%） 49 mL 0.1 M PB | |
| 洗涤缓冲液 2（50 mL） | |
| 混合 0.5 mL 正常山羊血清（终浓度：1%） 49.5 mL 0.1 M PB | |
表2：本方案中使用的抗体。
| 一抗 | |||
| 靶向抗原 | 宿主物种 | RRID | 浓度 |
| Mover | Rabbit | AB_10804285 | 1:1000 |
| Synaptophysin | Guinea pig | AB_1210382 | 1:1000 |
| 二抗 | |||
| 靶向物种 | 宿主物种 | 荧光染料 | 浓度 |
| Rabbit | Donkey | AlexaFluor 647 | 1:1000 |
| Guinea pig | Goat | AlexaFluor 488 | 1:1000 |
表3：数据处理示例。
| 半球 | |||||
| 半球编号 | Synaptophysin 平均荧光强度（A.U.） | Mover 平均荧光强度（A.U.） | Mover/Synaptophysin 比值 | ||
| 1 2 3 4 5 6 | 29.134 31.008 38.641 30.775 21.658 27.277 | 22.810 24.046 29.324 25.444 18.091 23.364 | =C3/B3 0.783 =C4/B4 0.775 =C5/B5 0.759 =C6/B6 0.827 =C7/B7 0.835 =C8/B8 0.857 | ||
| 海马 | |||||
| 半球编号 | Synaptophysin 平均荧光强度（A.U.） | Mover 平均荧光强度（A.U.） | Mover/Synaptophysin 比值 | 相对于半球的比值 | Mover 相对丰度（%） |
| 1 2 3 4 5 6 | 35.26 33.955 41.231 39.853 30.129 28.737 | 29.889 27.825 31.978 31.787 27.817 25.861 | =C11/B11 0.848 =C12/B12 0.819 =C13/B13 0.776 =C14/B14 0.798 =C15/B15 0.923 =C16/B16 0.900 | =D11/D3 1.083 =D12/D4 1.057 =D13/D5 1.022 =D14/D6 0.965 =D15/D7 1.105 =D16/D8 1.051 | =(E11-1)*100 8.269 =(E12-1)*100 5.673 =(E13-1)*100 2.200 =(E14-1)*100 -3.528 =(E15-1)*100 10.530 =(E16-1)*100 5.064 |
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 离心管 | Eppendorf | 30120094 | |
| 50 mL 离心管 | Greiner Bio-One | 227261 | |
| 24 孔板 | Fisher Scientific | 087721H | |
| 塑料移液管（一次性） | Sarstedt | 8,61,176 | |
| 1000 mL 移液器 | Rainin | 17014382 | |
| 2 mL 移液器 | Eppendorf | 3123000012 | |
| Vortex Genius 3 涡旋振荡器 | IKA | 3340001 | |
| Menzel 显微镜载玻片 | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| 体视显微镜 | Leica | ||
| LSM800 | Zeiss | 共聚焦显微镜 | |
| PBS (10X) | Roche | 11666789001 | |
| Tissue Tek | Sakura | 4583 | OCT |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| NaH2PO4 | Merck | 1,06,34,60,500 | |
| 正常山羊血清 | Merck Millipore | S26-100ML | |
| 正常驴血清 | Merck | S30-100ML | |
| Triton X-100 | Merck | 1,08,60,31,000 | |
| 兔抗 Mover 抗体 | Synaptic Systems | RRID: AB_10804285 | |
| 豚鼠抗 Synaptophysin 抗体 | Synaptic Systems | RRID: AB_1210382 | |
| 驴抗兔 AF647 荧光二抗 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2492288 | |
| 羊抗小鼠 AF488 荧光二抗 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2337438 | |
| Mowiol4-88 封片剂 | Calbiochem | 475904 | |
| ZEN2 blue 软件 | Zeiss | 显微成像软件 | |
| FIJI | ImageJ | 图像分析软件 | |
| Microsoft Excel | Microsoft |
