使用免疫荧光定量小鼠大脑中突触前蛋白的分布

Abstract

来源:Wallrafen， R. 等人 使用免疫荧光量化小鼠大脑中突触蛋白的异质分布。J. Vis. Exp. （2019 年）。

该视频演示了小鼠脑切片的免疫荧光染色，以量化特定突触前蛋白的分布。该过程包括封闭非特异性位点，应用靶蛋白的一抗和参考标记物，然后进行二抗标记和细胞核复染。参考标记物通过提供一致的基线来确保准确定量，并使用共聚焦显微镜分析突触前蛋白在大脑区域的分布。

Protocol

所有涉及动物样本的程序均已由适当的动物伦理审查委员会审查和批准。

1. 免疫荧光

1. 制备溶液，包括封闭缓冲液、抗体缓冲液、洗涤缓冲液 1 和洗涤缓冲液 2（见表 1）。
2. 用磷酸盐缓冲液 （PB） 冲洗切片一次，以去除多余的最佳切割温度 （OCT） 化合物。
   1. 用塑料移液管去除溶液，不要吸入脑切片。用 1000 μL 移液器加入 250 μL 新鲜 PB。
      谨慎:切片不应变干，因此请取出并充分添加液体。
3. 用塑料移液管去除 PB，并用 1000 μL 移液管每孔添加 250 μL 封闭缓冲液。在室温 （RT） 下在摇床上孵育 3 小时。
4. 在孵育期间，在反应管中的抗体缓冲液中稀释一抗。每孔使用 250 μL 抗体缓冲液，并使用 2 μL 移液器直接移液到溶液中，加入适量的抗体（见表 2）。通过轻轻上下吹打数次来混合溶液。不久后涡旋以确保正确混合。
   注意:为了确定背景荧光，也应在不添加一抗的情况下进行染色。为此，根据方案在不含一抗的抗体溶液中孵育切片。
5. 孵育时间后，用塑料移液管去除封闭缓冲液，每孔加入 250 μL 含有一抗的抗体溶液。将切片与一抗在 4 °C 下在摇床上孵育过夜。
6. 第二天，在摇床上用洗涤缓冲液 1 3 次洗涤切片，在 RT 上洗涤 10 分钟。
   1. 用塑料移液管去除培养基，每孔加入 300 μL 洗涤缓冲液 1。在 RT 孵育 10 分钟。重复 3 次。
7. 在洗涤步骤中，在反应管中的抗体缓冲液中稀释荧光基团偶联的二抗。每孔使用 250 μL 抗体缓冲液，并使用 2 μL 移液器直接移液到溶液中，加入适量的抗体（见表 2）。通过轻轻上下吹打数次来混合溶液。不久后涡旋以确保正确混合。
   谨慎:由于抗体对光敏感，因此从此开始的所有步骤都需要在黑暗中进行。
8. 洗涤步骤后，用塑料移液管去除洗涤缓冲液，每孔加入 250 μL 含有二抗的抗体溶液。将切片与二抗在 RT 下避光孵育 90 分钟。
9. 在 RT 下用洗涤缓冲液 2 3 次洗涤切片 10 分钟。
10. 在洗涤步骤中，在 0.1 M PB 中以 1:2000 的浓度稀释 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI）。
11. 用塑料移液管去除洗涤缓冲液 2，每孔加入 250 μL DAPI 溶液。在摇床上于 RT 孵育 5 分钟。
12. 用塑料移液管去除 DAPI 溶液，用 1000 μL 移液管每孔添加 500 μL 0.1 M PB。
13. 将切片安装在显微镜载玻片上。
    1. 将显微镜载玻片放在立体镜下方。用细刷，在玻片上加入三滴 0.1 M PB。将每滴一片放在显微镜载玻片上。
    2. 使用细刷将显微镜载玻片上的切片展平并定向。
    3. 当所有切片都正确定位后，用纸巾去除多余的 PB 并小心地擦干玻片。
       谨慎:避免完全干燥脑切片。
    4. 在载玻片上加入 80 μL 包埋培养基。小心地将盖玻片降低到载玻片上，从而嵌入脑切片。
    5. 将载玻片在通风橱中干燥 1-2 小时（盖上以避免光照），并将它们存放在 4 °C 的显微镜载玻片盒中><。 注意: 该协议可以在此处暂停。

2. 成像

1. 包埋介质完全硬化后，将显微镜载玻片置于共聚焦显微镜下。
   注意:落射荧光显微镜与反卷积软件相结合应产生相似的图像质量。
2. 通过增加或减少每个通道的激光强度来调整激光设置，以便少数像素过度曝光，从而确保灰度值的最大分布。
3. 获取不同通道的全脑切片的虚拟组织。
   1. 在成像软件中，选择 Tiles 选项并使用 Tile Region Setup 手动描绘脑切片。
   2. 在整个瓦片区域分布支撑点，并通过按 Verify Tile Regions/Positions...（验证瓦片区域/位置...）来调整不同支撑点的焦点。
   3. 根据生成图像的所需分辨率和文件大小调整采集模式下的设置，然后开始扫描。
4. 扫描完成后，使用 Stitching 功能处理虚拟组织。使用 Image Export 功能将文件导出为 .tif。

3. 基于计算机的分析

1. 通过单击文件 |打开。
2. 使用手绘选择工具，在 DAPI 通道中描绘一个半球。通过单击 Edit|选型|创建蒙版。
3. 通过单击分析|Measure.
   注意:确保选择不同的通道以确定每个通道的平均荧光强度值。
4. 将单个通道的平均荧光强度复制到电子表格中。
5. 通过使用 Freehand 选择工具描绘该区域，确定感兴趣区域中单个通道的平均荧光强度。使用小鼠脑图谱作为参考。
6. 对所有半球和所有感兴趣区域重复步骤 3.1-3.5。
   注意:分别确定每个半球的值，以便稍后将感兴趣区域中的值与半球中的值进行比较（请参阅步骤 4.2）。

4. 数据处理

1. 如果背景荧光很高，则可能需要减去背景。为此，确定在没有针对参考蛋白的一抗（此处:突触素）的情况下加工的切片的平均荧光强度，并从获得的所有脑区和半球值中减去该值。
2. 当确定了每个半球和每个感兴趣区域的单个通道的平均荧光强度时（见表 3），通过将 Mover 的值除以突触素的值（表 3 中的黄色）来计算 Mover 与突触素的比率。分别对每个半球和每个感兴趣区域执行此作。
3. 将一个感兴趣区域获得的比率除以相应半球（表 3 中的橙色）获得的比率，以确定感兴趣区域与该半球的比率。
4. 要确定相对 Mover 丰度，通过确定其与 1 的偏差（表 3 中的红色），将 4.2 中获得的比率转换为百分比。因此，比率为 1.25 的相对移动者丰度将比平均值高 25%，而比率为 0.75 的相对移动者丰度将比平均值低 25%。

表 1:本协议中使用的解决方案。

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 固定剂 （500mL） 混合 20g 多聚甲醛（总浓度:4%）
50 mL 10x PBS 储备液（总浓度:1x）
450 mL bidest H₂O，pH 值为 7.4，含 NaOH
注意:要溶解 PBS 中的多聚甲醛，请加热溶液。不要加热超过 70 ^°C，因为 PFA 会在高于 70 ^°C 的温度下分解><。 注意:PFA 有毒、潜在致癌和致畸。使用 PFA 时戴手套，并在通风橱下工作。避免摄入。 0.1 M PB （1升） 储备液 X
35.61 克 Na₂HPO_4.2 H₂O 在 1 L bidest H₂O 中 储备液 Y
27.60 克 NaH₂PO_{4.2H 2}O 在 1 L bidest H₂O 中 混合 385 mL 储备液 X
115 mL 储备液 Y
500 mL bidest H₂O 封闭缓冲液 （50 mL） 混合 1.25 mL 正常山羊血清（总浓度:2.5%）
1.25 mL 正常驴血清（总浓度:2.5%）
0.5 mL 非离子表面活性剂（Triton-X100，总浓度:1%）
47 mL 0.1 M PB 抗体缓冲液 （50 mL） 混合 0.25 mL 正常山羊血清（总浓度:0.5%）
0.25 mL 正常驴血清（总浓度:0.5%）
0.1 mL 非离子表面活性剂（总浓度:0.2%）
49.4 mL 0.1 M PB 洗涤缓冲液 1 （50 mL） 混合 1 mL 正常山羊血清（总浓度:2 %）
49 mL 0.1 M PB 洗涤缓冲液 2 （50 mL） 混合 0.5 mL 正常山羊血清（总浓度:1 %）
49.5 mL 0.1 M PB

表 2:本实验步骤中使用的抗体。

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 一抗 针对 宿主物种 RRID 浓度 动机 兔 AB_10804285 1:1000 突触素 豚鼠 AB_1210382 1:1000 二抗 目标物种 宿主物种 荧光基团 浓度 兔 驴 亚历克萨荧光 647 1:1000 豚鼠 山羊 亚历萨荧光 488 1:1000

表 3:数据处理示例。

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 半球 半球 # 平均荧光强度突触素 （A.U.） 平均荧光强度移动器 （A.U.） 比率移动器/突触素 1
2
3
4
5
6 29.134
31.008
38.641
30.775
21.658
27.277 22.810
24.046
29.324
25.444
18.091
23.364 元 =C3/B3 0.783
=C4/B4 0.775
=C5/B5 0.759
=C6/B6 0.827
=C7/B7 0.835
=C8/B8 0.857 海马体 半球 # 平均荧光强度突触素 （A.U.） 平均荧光强度移动器 （A.U.） 比率移动器/突触素 与半球的比率 相对移动者丰度 （%） 1
2
3
4
5
6 35.26
33.955
41.231
39.853
30.129
28.737 元 29.889
27.825
31.978
31.787
27.817
25.861 =C11/B11 0.848
=C12/B12 0.819
=C13/B13 0.776
=C14/B14 0.798
=C15/B15 0.923
=C16/B16 0.900 =D11/D3 1.083
=D12/D4 1.057
=D13/D5 1.022
=D14/D6 0.965
=D15/D7 1.105
=D16/D8 1.051 =（E11-1）*100 8.269
=（E12-1）*100 5.673
=（E13-1）*100 2.200
=（E14-1）*100 -3.528
=（E15-1）*100 10.530
=（E16-1）*100 5.064

Materials