评估 Drosophila 背部纵向肌肉神经肌肉接头的结构完整性

摘要

来源：Sidisky, J. M., 等 可视化成年个体中的突触变性 果蝇 与神经退行性变相关 J. Vis. Exp. (2020).

本视频展示了一种用于评估背侧纵肌中神经肌肉接头结构完整性的实验方案 黑腹果蝇该过程涉及使用两种不同的抗体对神经元和肌肉进行染色，并比较突变型与野生型果蝇之间的荧光模式。突变型果蝇中神经元染色信号的减弱表明存在神经变性，而肌肉结构保持完整。

方案

1. 快速冷冻与胸部切开

1. 开始切半操作前，佩戴适当的低温防护手套和安全眼镜，向杜瓦瓶中加入液氮。准备刀片断裂器、羽状刀片、一对精细镊子、冰、冰冻的1×PBS以及低温镊子。
2. 准备一个冰桶，用于保持1×PBS处于冰冻低温状态。
3. 使用刀片断裂器以一定角度夹住羽状刀片，弯曲刀片以折下小块刀片。随后可用刀片断裂器将刀片固定在适当位置，作为小型解剖刀使用。
   注意：一片刀片应可供所有组使用。若刀片断裂或变钝，则更换新刀片。
4. 在P200移液器上安装一个洁净的吸头，并切除吸头前端约五分之一部分，以便转移样品。
5. 为每组准备一个新的微量离心管，并向每管中加入200 μL的1×PBS。此第二组试管将用于收集最终的DLM样本。
6. 使用巴斯德移液管从各管中移除所有1×PBS。
7. 佩戴适当的个人防护装备，用低温镊子将离心管浸入液氮罐中10秒。
   注意：离心管必须紧密封闭，以防管体因液氮进入而爆炸。
8. 将离心管从液氮中取出，用巴斯德移液管向样品中加入约300 μL冰冻的1×PBS。样品需始终保持在冰上。
9. 向涂有硅橡胶弹性体的10 cm解剖皿中加入冰冻的1×PBS，并用改装后的200 μL移液器加入第一个胸部样本。
10. 将胸部样本腹面朝上放置。一手使用钝头镊子固定胸部位置，另一手使用精细镊子移除部分胸神经节，以暴露胸部中线。
11. 以胸部中线为引导，使用刀片在胸部三分之一深度处进行浅层切割。
12. 将刀片从胸部移开，用钝头镊子将胸部调整至45°角。重新插入刀片，并沿胸部中线垂直向下切割。由此获得两个半胸部（hemithoraces）。
13. 每次取一个半胸部，去除DLM肌肉纤维F（图1B，最腹侧的纤维）下方的多余组织。使用刀片小心地进行一至两次切割，以去除多余组织，同时避免损伤DLM肌肉。
14. 分离完成后，将半胸部转移至含有1×PBS的对应离心管中。
15. 重复步骤1.6‒1.14，直至每组获得10个解剖完成的半胸部样本。

2. 结构染色

1. 将胸部样本切开后，放入封闭缓冲液（1x PBS 含 0.1% 正常山羊血清和 0.2% Triton X-100，pH 7.4）中，以通透组织并防止非特异性染色。使用巴斯德吸管去除多余的 1x PBS，并向每管中加入 1.5 mL 封闭缓冲液。在 4 °C 下封闭组织至少 1 小时。
2. 使用荧光标记的抗体辣根过氧化物酶 488（anti-HRP-488）以 1:200 稀释度和 Phalloidin-647 以 1:1000 稀释度溶于封闭缓冲液中，分别对运动神经元和肌肉组织进行结构染色。每管准备 150 μL 染色液。将染色液置于 4 °C 下避光保存（用铝箔包裹或放入暗盒），待染色时使用。
3. 封闭完成后，用玻璃巴斯德吸管去除多余的封闭缓冲液。
4. 在加入结构染色液前，先将染色液涡旋混匀。向每管中加入 150 μL 染色液。将样本置于暗盒中，在室温下于摇床上避光孵育 2 小时。
5. 去除染色液后，在暗盒中用含 0.3% Triton X-100 的 1.5 mL 室温 1x PBS 溶液在摇床上清洗组织 4 次，每次 5 分钟。样本现可进行载玻片封片。

3. 组织切片的固定

1. 用 PBST 清洗样本后，准备显微镜载玻片以固定组织进行染色。同时准备其他用品，包括玻璃盖玻片、P200 移液器、200 μL 移液器吸头、剪刀、透明加固环、直头镊子、抗荧光淬灭封片剂、指甲油以及用于覆盖载玻片的避光盒。
2. 标记载玻片以识别样本，并用 Kim 擦纸清洁载玻片表面，去除任何污迹。
3. 为防止盖玻片损坏半胸样本，使用加固环构建一个“桥”。将一个加固环切成两半，将两半分别放置，间距约 15 mm。此距离必须小于盖玻片的宽度。重复此步骤四次，形成一个由五层加固环构成的“桥”。
4. 取 P200 移液器，并通过剪去吸头前端约五分之一的方式改装吸头，用于将样本转移至载玻片上。样本应置于“桥”的中央位置。
5. 用实验擦拭纸边缘吸除多余的 PBST。使用镊子调整 DLMs，使所有样本的肌肉面朝上、角质层面朝下。
6. 使用标准 P200 移液器吸头，向载玻片上加入 70 μL 封片剂，避免产生气泡。从加固环外侧开始向中心以环形方式滴加封片剂。
7. 将盖玻片覆盖在加固环上方。
8. 用指甲油涂抹盖玻片四周外缘，充分涂抹以形成对组织的完全密封。
9. 将载玻片平放在避光处，静置至少 10 分钟使其干燥，防止光漂白或荧光信号丢失。载玻片可立即用于成像，或存放于 -20 °C 的载玻片盒中以备后续观察。

结果

图1： 在肌萎缩侧索硬化症（ALS）的 Drosophila 模型中DLM突触进行性失神经支配。（A） 示意图展示了表达人类43 kDa TDP-43蛋白突变体（Tar-Binding Protein of 43 kDa, TDP-43）的ALS转基因果蝇的构建过程。（B） 图示为成年 Drosophila 半胸节的形态与方位。通过本实验方案，我们可利用HRP对运动神经元（绿色）和Phalloidin对肌肉组织（品红色）进行结构染色，观察DLM神经肌肉接头（NMJ）突触完整性随时间的进行性丧失。本模型通过在运动神经元中表达人源TDP-43M337V突变体的成年...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
32% 甲醛	Electron Microscopy Sciences	15714	组织保存
BenchRocker	Genesee Scientific	31-302	染色过程中旋转样品
刀片夹持器（Blade Breaker）	Fine Science Tools	10053-09	用于固定羽毛刀片
盖玻片	Fisher Scientific	12548A	用于组织封片
低温手套	VWR	97008-198	保护手部免受液氮伤害
低温镊子	VWR	82027-432	用于夹持2.0 mL离心管浸入液氮
杜瓦瓶（1900 mL）	Thomas Scientific	5028M54	盛装液氮
羽毛刀片	Electron Microscopy Sciences	72002-01	手术刀片
精细镊子 × 2	Fine Science Tools	11252-20	一对精细镊子用于清除胸部中线组织；另一对可用磨刀石钝化处理
FITC标记的抗HRP抗体	Jackson Laboratories	123-545-021	标记运动神经元，使用浓度为1:100
冷冻盒（黑色）	Fisher Scientific	14100F	保护样品免受光照
玻璃巴斯德吸管	VWR	14637-010	用于转移样品
载玻片	Fisher Scientific	12550143	用于组织封片
封片剂（Vectashield）抗荧光淬灭剂	VWR	101098-042	封片剂可保留荧光信号
指甲油	Electron Microscopy Sciences	72180	密封显微镜载玻片
正常山羊血清	Fisher Scientific	PCN5000	防止抗体非特异性结合
画笔	Genesee Scientific	59-204	转移果蝇
PBS	Fisher Scientific	10-010-023	用于解剖和染色的生理盐水溶液
Phalloidin 647	Abcam	AB176759	标记肌肉组织中的F-肌动蛋白，使用浓度为1:1000
塑料培养皿（100 mm）	VWR	25373-100	解剖皿
加强型标签纸	W.B. Mason	AVE05722	为覆盖在组织上的盖玻片提供支撑
磨刀块	Grainger	1RDF5	保持一对精细镊子锋利，并将另一对镊子钝化
载玻片存放夹	VWR	10126-326	样品储存
标准办公剪刀	W.B. Mason	ACM40618	裁剪加强型标签纸
Sylgard 184	Electron Microscopy Sciences	24236-10	用于解剖皿的涂层
Triton-X-100	Electron Microscopy Sciences	22140	有助于组织通透
Vannas解剖剪	Fine Science Tools	1500-00	用于去除果蝇腿部并在胸部做切口