评估果蝇背纵肌神经肌肉接头的结构完整性

1. 闪冻和胸部平分

1. 在开始剖分之前，戴上适当的冷冻防护手套和安全眼镜，用液氮填充杜瓦瓶。获得刀片破碎机、羽毛刀片、一对细镊子、冰、冰冷的 1x PBS 和低温镊子。
2. 准备一个冰桶以保持 1x PBS 冰冷。
3. 使用刀片破碎机以一定角度抓住羽毛刀片并弯曲刀片以折断一小块。然后，刀片断路器可以将刀片锁定到位，以便用作小手术刀。
   注意: 一个刀片应该适用于所有组。如果刀片断裂或变钝，请切换。
4. 向 P200 上添加干净的移液器吸头，然后取下 1/5 的吸头以运输样品。
5. 为每组准备一个新的微量离心管，并向每个管中加入 200 μL 1x PBS。第二支试管将用于收集最终的 DLM 制备物。
6. 使用巴斯德移液管从试管中取出所有 1x PBS。
7. 穿戴适当的防护设备，用低温镊子将试管浸入液氮瓶中 10 秒。
   注意: 管子应紧闭，以防止管子爆炸。
8. 从液氮中取出试管，用巴斯德移液管向样品中加入大约 300 μL 冰冷的 1x PBS。将样品放在冰上。
9. 将冰冷的 1x PBS 添加到涂有硅弹性体的 10 cm 解剖皿中，并用改良的 200 μL 移液器分配第一个胸部。
10. 将胸部腹侧朝上。一只手用一对钝钳定位胸部，另一只手用一把细镊子去除一些胸神经节，露出胸部中线。
11. 以胸部的中线为导向，用刀片在胸部的 1/3 处进行浅切。
12. 从胸部取下刀片，用钝镊子将胸部呈 45° 角定位。重新插入刀片并沿着胸部中线笔直切割。这将导致两个半胸。
13. 一次取一个半胸，并去除最腹侧纤维 DLM 肌肉纤维 F（图 1B）下的多余组织。使用刀片小心地进行一两次切割，以去除多余的组织，而不会损坏 DLM。
14. 分离后，用 1x PBS 将半胸转移到正确的试管中。
15. 重复步骤 1.6-14，直到每组制作 10 个解剖半胸。

2. 结构染色

将
1. 胸部样品一分为二后，将组织置于封闭缓冲液（1x PBS 与 0.1% 正常山羊血清和 0.2% Triton X-100，pH 值为 7.4）中，以透化组织并防止非特异性染色。使用巴斯德移液器去除多余的 1x PBS，并向每个试管中加入 1.5 mL 封闭缓冲液。在 4 °C 下封闭组织至少 1 小时。
2. 使用荧光偶联抗体、1:200 稀释度的辣根过氧化物酶 488（抗 HRP-488）和稀释度为 1:1000 的鬼笔环肽-647 在封闭缓冲液中制备用于结构染色的样品，以分别对运动神经元和肌肉组织进行染色。制作足够的染色剂，每管有 150 μL。将染色剂储存在 4 °C 下，用箔纸覆盖或放在暗盒中，直到准备好染色。
3. 封闭后，用玻璃巴斯德移液管去除多余的封闭缓冲液。
4. 在分配结构染色剂之前，涡旋染色剂。向每个试管中加入 150 μL 染色剂。将样品在室温下放在旋转器上的暗盒中 2 小时。
5. 去除污渍，并在暗箱中的旋转器上用 1.5 mL 室温 1x PBS 和 0.3% Triton X-100 洗涤组织 5 分钟。样品现在可以封片到载玻片上。

3. 安装纸巾

1. 在 PBST 中洗涤样品后，准备显微镜载玻片以安装组织进行染色。准备额外的用品，包括玻璃盖玻片、P200 移液器、200 μL 移液器吸头、剪刀、透明加固、直边镊子、防褪色荧光封固剂、指甲油和覆盖载玻片的暗盒。
2. 标记载玻片以识别样品，并用 Kim 湿巾清洁以去除任何污迹。
3. 为确保盖玻片不会损坏半胸样品，请使用增强标签构建一个"桥"。将一个钢筋标签切成两半，并将每半间隔约 15 毫米。此距离必须小于盖玻片的宽度。重复此步骤四次，以完成一个 5 个标签高的"桥"。
4. 取 P200 移液器，通过切掉 1/5 的吸头来修改吸头，以将样品转移到载玻片上。样品应转移到桥中央的载玻片上。
5. 拿起实验室擦拭布的边缘，去除多余的 PBST。使用镊子排列 DLM，使所有样品都面向肌肉面朝上，角质层面朝下。
6. 使用标准 P200 移液器吸头，将 70 μL 封固剂涂抹在载玻片上，避免气泡。在增强材料内部以圆形模式分配介质，从外部开始到中心。
7. 在钢筋上放置盖玻片。
8. 使用指甲油涂抹盖玻片周边的外边缘。大量涂抹以形成组织的完全密封。
9. 将载玻片放在黑暗中的平坦表面上，至少干燥 10 分钟并防止光漂白或荧光损失。载玻片现在可以立即用于成像，或以其他方式存储在 -20 °C 的载玻片文件夹中以供以后查看。

图 1:ALS 果蝇模型中 DLM 突触的进行性去神经支配。（A） 示意图中显示了表达 43 kDa 焦油结合蛋白 （TDP-43） 的人类突变形式的 ALS 转基因果蝇的产生。（B） 该插图描绘了成年果蝇半胸的形状和方向。使用该方案，我们可以通过用 HRP（绿色）对运动神经元和用鬼笔环肽（洋红色）对肌肉组织进行结构染色来观察 DLM NMJ 突触完整性的进行性丧失。我们的模型描述了 ALS 成年模型中突触完整性的丧失，通过与肌肉纤维 C 中的 WT（图 1C）相比，成年果蝇在运动神经元中表达人类 TDP-43M337V 突变体（图 1F\u2012H）。箭头突出显示了 WT 突触的例子（图 1C）和突触完整性丧失的例子。比例尺 = 20 μm，放大倍率为 63 倍。