利用大规模扫描透射电子显微镜研究斑马鱼幼体脑损伤

摘要

来源：Kuipers, J. 等., 健康与损伤斑马鱼脑组织的大规模扫描透射电子显微镜成像（纳米解剖学）. J. Vis. Exp. (2016)。

本视频演示了一种利用大规模扫描透射电子显微镜（STEM）研究斑马鱼幼体脑损伤的方法。STEM技术结合了扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）的特点，可生成高分辨率图像。本文概述了样品制备的步骤以及高分辨率STEM图像的获取过程，以用于识别脑损伤。

方案

1. 样品制备

1. 固定与包埋
   1. 固定
      1. 用添加了三卡因（0.003%）的E3溶液（5 mM NaCl，0.17 mM KCl，0.33 mM CaCl₂）麻醉鱼 larvae₂，0.33 mM MgSO₄_4, 10 mM HEPES，pH 7.6）的斑马鱼养殖水，并在解剖显微镜下用200 µl移液器吸头轻轻触碰以检测麻醉深度，直至不再观察到运动反应（图1A).
      2. 在获取相关联的电子显微镜（EM）样本之前进行样品处理时 体内 使用共聚焦或双光子成像技术在1.8%琼脂糖中获取成像数据，随后按照所述方法用含0.05%吐温-100的磷酸盐缓冲液（PBS）配制的4%多聚甲醛（PFA）固定幼虫。
      3. 从琼脂糖中切出幼虫并进行大规模电镜制样。
      4. 在塑料管中，室温下用含 0.05% Triton-X-100 的新鲜 4% 多聚甲醛 PBS 溶液固定幼虫 2 小时。
         注意： 培养细胞体外) 可直接用戊二醛固定，具体步骤见下一步（1.1.1.5）。
      5. 去除溶液，加入 100 µl 含 0.5% 多聚甲醛、2% 戊二醛（GA）和 0.1 M 二甲胂酸钠（pH 7.4）的混合液。4 °C 下避光保存过夜。用 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液清洗样品两次。
      6. 在延髓前方横切幼虫头部，以促进锇的渗透。使用精细的注射器或镊子。
      7. 用1%四氧化锇（OsO₄）固定幼虫₄)/1.5% 亚铁氰化钾（K₄[Fe(CN)₆]) 在0.1 M 冰冷的二甲胂酸钠溶液中孵育2小时，然后用双蒸水冲洗3次，每次5分钟₂O.
      8. 在递增浓度的乙醇（50%、70%、100%三次）中依次孵育20分钟进行脱水。
   2. 包埋
      1. 根据电子显微镜实验室常用的标准配方制备环氧树脂。
         注意： 我们按如下方法使用环氧树脂：将19.8 g环氧氯丙烷二酚醚100、9.6 g 2-十二烯基琥珀酸酐和11.4 g甲基纳迪克酸酐置于磁力搅拌器中混合。加入0.5 g DMP-30（三（二甲氨基甲基）苯酚），再次混合均匀。
      2. 在50%环氧树脂乙醇溶液（v/v）中避光旋转孵育幼虫过夜（室温）。
      3. 用纯树脂替换稀释的环氧树脂。室温孵育30分钟，加入新鲜树脂再次孵育30分钟。再次更换新鲜树脂，先在室温下孵育3小时，随后在58 °C孵育15分钟，再于室温下低真空（200 mbar）孵育1小时。
      4. 在解剖显微镜下，使用细针或牙签将头部在商用硅胶平底包埋模具中定向，使头部前方朝向模具侧壁或按需要方向摆放（图1B).
      5. 在58 °C下过夜聚合环氧树脂。若环氧树脂仍过软，则在58 °C下继续聚合和硬化一天。使用镊子施加压力测试硬度。若轻易留下压痕，则再在58 °C下继续聚合和硬化一天。当样本完全硬化后，进行修块和切片。
      6. 使用剃刀刀片从 stub 上切除多余的树脂图 1B).
2. 切片、染色与封片
   1. 切片
      1. 使用超薄切片机对环氧树脂包埋块进行切片。
      2. 使用玻璃刀或钻石组织切片刀切割半薄切片（500 nm），用于亚甲蓝/碱性品红染色（图1D染色以检测定位是否正确。
      3. 用火焰封闭巴斯德玻璃移液管的尖端，以此吸取半薄切片并转移至载玻片上。在加热板上烘干至无水分残留。在加热板上用1%亚甲蓝水溶液染色10秒，水洗后，再用含1%四硼酸钠的0.05%碱性品红溶液染色10秒。使用普通光学显微镜在10X至40X倍数下观察。
      4. 当到达脑内合适的位置/方向后，继续使用金刚石刀对环氧树脂块进行切片，以获得超薄切片（约 70 nm； 图1E)
      5. 利用大脑内部及周围的易于识别的解剖结构（包括嗅窝、眼睛以及灰质-白质边界）来确定超薄切片过程中的目标区域，并在样本发生倾斜时调整切片角度。
      6. 将切片置于单槽L2 x 1铜网上图1F），以避免网格条纹干扰成像。使用甲醛涂层载网支撑切片。
   2. 对比
      1. 在甲醇中含2%醋酸铀染色液中对载网上的超薄切片染色2分钟，随后用Reynolds柠檬酸铅染色液染色2分钟。

2. 图像采集

1. 大规模扫描透射电子显微镜（STEM）
   注意： 我们采用配备外部扫描发生器的扫描电子显微镜，结合STEM检测模式，可在高分辨率下获取多个大视野图像。通常，以此方式获得的一幅图像相当于约100张透射电子显微镜（TEM）图像的视野范围，显著减少了图像拼接的工作量。
   1. 显微镜样品安装
      1. 将带有切片的网格放入多网格样品 holder 中，并转移至扫描电镜（SEM）样品室。
   2. STEM探测器的校准
      1. 将带有样品的载网置于电子束下，并向上移动，使其距离物镜极靴约5 mm。使用镜内探测器在20 kV下采集图像。
      2. 聚焦于网格边缘，调节工作距离至4.0 mm。
      3. 将样品台移至安全位置，并引入STEM探测器。
      4. 通过使用镜内探测器以最高速度成像，同时调节调整螺丝，将STEM探测器的孔径置于图像视野中心。
      5. 小心地将样本支架移回，使其恰好位于透镜极靴与探测器之间。
      6. 使用镜内探测器获取图像，以确认其位于切片区内。
      7. 切换至 STEM 检测模式（增益设为中等，所有象限设为“负”），采集图像，并选择待扫描区域。
      8. 将加速电压升至21 kV，并等待电子束稳定（图像再次稳定），然后以2 kV为步长逐步升至29 kV。
   3. 获取图像
      1. 通过放大视野，使待扫描的整个区域均包含在图像窗口内，对样品进行预照射（以防止电子束引起的亮度变化）。
      2. 将孔径调整为 120 µm（为了保持适当的动态范围，检测器增益需降低一级）。
      3. 失焦，使图像模糊。
      4. 使用减小扫描区域选项，使扫描区域尽可能小。
      5. 设置扫描速度，使每帧的扫描时间约为1至2秒。
         注意： 根据样本大小和组织类型，通常需要½小时（100 × 100 µm视野（FOV））至长达3小时（1,000 × 500 µm）。
      6. 至少放大100倍，对小区域扫描10秒。
         注意： 当该区域与其周围区域的亮度相比没有变化时，预照射已足够。
      7. 重新安装30 µm光阑（并将STEM增益调至中等）
      8. 聚焦于样本。
      9. 使用摇摆器（在约 40,000 倍放大倍数下）调节光阑对中。
      10. 聚焦后，选择最亮的区域或特征，并调整扫描速度以确保细节清晰可见。
      11. 在显微镜软件中，通过仔细观察直方图来调整亮度和对比度，确保所有像素均处于动态范围内。对最暗的区域或特征进行同样的操作。
      12. 返回亮区并再次检查。为确保安全，直方图两侧应留有一定空间。
      13. 缩小视野，使待扫描的整个区域均位于成像窗口内，然后启动大范围采集程序。
      14. 使用向导选项，通过从屏幕中选择一个区域来设置拼图图像。根据所需细节，采用 2 - 5 nm 的像素尺寸。STEM 模式下使用 3 µs 的停留时间。
      15. 选择“在前一个图块上自动对焦”选项，使用大尺度成像软件的自动对焦功能（采用厂商默认设置），勾选“执行前验证设置”复选框，并定义数据保存位置。
      16. 点击“optimize”以检查显微镜设置。
          注意： 现在将显示所需时间。对于1 × 0.5 mm的区域，时间可能长达72小时。
      17. 在窗口中，“最大瓦片分辨率”输入 20,000，以便单个瓦片不超过 20k × 20k，从而避免产生钝边效应。点击“执行”。
      18. 当提示检查焦距和亮度/对比度（B/C）时，关闭外部扫描发生器，并在显微镜软件中仔细调节焦距和像散。不要更改亮度/对比度（B/C）。
          注意： 载物台可以移动，放大倍数也可以更改，但必须将放大倍数重新设置为所需的像素尺寸。
      19. 再次打开外部扫描发生器并按下“继续”。

结果

图 1：斑马鱼大脑大规模组织电子显微镜工作流程。（A） 7 日龄斑马鱼幼体。（B） 并排包埋于环氧树脂中的斑马鱼幼体头部。（C） 用于半薄切片及样品定向的玻璃刀。（D） 代表性半薄切片（甲苯胺蓝染色），显示两个并排包埋的斑马鱼幼体。（E） 用于切割超薄切片（70 nm）的钻石刀。（F） 对（D）中图像进行编辑，展示完整斑马鱼幼体脑切片在单孔载网上用于指示位置。（G） 本研究中用于大规模二...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
化学试剂
低熔点琼脂糖	VWR	444152G
三卡因	Sigma	E10521
吐温- X-100	Sigma	X100
戊二醛	Polysciences	1909
二甲胂酸钠	Sigma	C0250
四氧化锇	Electron Microscopy Sciences	19114
亚铁氰化钾 (K4[Fe(CN)]6)	Merck	4984
乙醇	VWR	20821.365
醋酸铀酰	Merck	8473
四硼酸钠	Merck	1063808
甲苯胺蓝	Merck	1273
碱性品红	BDH	340324
柠檬酸铅	BDH	discontinued
EPON
2-十二烯基琥珀酸酐	Serva	20755
甲基纳迪克酸酐	Serva	29452
缩水甘油醚 100	Serva	21045
DMP-30	Polysciences	553
标准平底包埋模具	Electron Microscopy Sciences	70901
金刚石刀	Diatome Inc.
铜网	Electron Microscopy Sciences
双面碳导电胶带	Electron Microscopy Sciences
扫描电镜 Zeiss Supra55	Zeiss
超薄切片机 Leica EM UC7	Leica
Atlas 外部扫描发生器	Fibics