人胚胎干细胞向神经类器官的分化与成熟

摘要

来源：Cosset, E.，等。用于研究脑癌与神经退行性疾病的类人神经类器官。J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了将人类胚胎干细胞诱导为神经类器官的逐步操作方案。该方法包括诱导神经玫瑰花环结构的形成，随后进行可控的成熟过程，最后在疏水性膜上培养，以获得完全发育的神经类器官。

方案

1. 未分化人胚胎干细胞（hESCs）的维持与培养

1. 通过使用特定细胞外基质预包被培养皿，在无饲养层条件下进行hSEC的维持和扩增。
   1. 在4 °C下解冻300 µL细胞外基质（典型浓度范围为18-22 mg/mL，解冻时置于冰上），并轻轻加入15 mL冷DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）中混合，以避免细胞外基质过早凝胶化。将7.5 mL细胞外基质加入两个T150培养瓶中。
   2. 将包被有细胞外基质的培养皿在37 °C孵育至少1小时（最长可过夜）。
   3. 移除培养基，并以6.5 × 10⁴ 个细胞/cm²的密度接种hESCs。
2. 将H1（hESC细胞系）维持在hESC培养基中，并添加1%青霉素/链霉素。
3. 采用酶法传代细胞：在37 °C条件下，于1-2分钟内向T75 cm²培养瓶中加入7.5 mL酶解溶液。待细胞完全脱落后，加入7.5 mL DMEM-F12，随后以300 × g离心5分钟。为提高细胞存活率，将细胞以所需密度重新接种至包被有细胞外基质的培养皿中，并在培养基中加入Rho相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂（10 µM），继续培养24小时。

2. 人胚胎干细胞来源的神经类器官

1. 开始三维培养前24小时，将hESC培养基更换为添加了10 µM ROCK抑制剂的无血清培养基（两种成分均需添加，以支持细胞在微孔板聚集阶段的存活及神经球的自发形成）。细胞汇合度应达到60%。次日（第0天），将hESC集落消化为单细胞：吸除培养基，用不含Ca²⁺/Mg²⁺的PBS洗涤，加入5 mL酶解液，于37 °C孵育1-2分钟。
2. 用添加了10 µM ROCK抑制剂的无血清培养基收集细胞，以300 × g离心5分钟。弃上清，将细胞重悬于10 mL含10 µM ROCK抑制剂的无血清培养基中并计数。
3. 同时，用每孔2 mL无血清培养基冲洗微孔板，并以1200 × g离心5分钟以去除所有气泡，防止气泡影响神经球形成。
4. 将28.2 × 10⁶个细胞重悬于12.5 mL含10 µM ROCK抑制剂的无血清培养基中，按每微孔1000个细胞进行接种。以300 × g离心5分钟，随后将微孔板置于37 °C培养箱中过夜（最长不超过36小时）。例如，为获得30个人类神经类器官，可使用一个汇合度为70%-80%的T150培养瓶（约含3000万个细胞）。
5. 次日（第1天），用P1000移液器收集神经球并转移至6孔板中。每孔加入2 mL B27培养基，即DMEM-F12 GlutaMAX与Neurobasal培养基按1:1比例混合，并补充1% B27添加剂和1%非必需氨基酸（NEAA）。为促进快速神经诱导，需在培养基中添加双重SMAD（Sma和Mad相关蛋白）抑制剂混合物，包括10 µM TGFβ（转化生长因子-β）/Activin/Nodal抑制剂和0.5 µM骨形态发生蛋白（BMP）抑制剂。自此步骤起，神经球需在旋转培养条件下（60 rpm，轨道摇床）培养。旋转至关重要，可防止神经球相互粘连或粘附于孔板壁。
6. 每2-3天更换一次培养基：将孔板倾斜，静置5分钟使神经球沉降，吸除一半培养基（2 mL），加入2 mL新鲜B27培养基（含生长因子和抑制剂）。切勿对神经球进行离心。
7. 按照以下时间进程进行神经诱导：
   1. 第1-4天：在补充了双重SMAD抑制剂的B27培养基中培养神经球。双重SMAD抑制剂混合物（10 µM TGFβ/Activin/Nodal抑制剂和0.5 µM BMP抑制剂）可促进神经诱导。
   2. 第4-11天：在补充双重SMAD抑制剂的B27培养基中添加10 ng/mL表皮生长因子（EGF）和10 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），以促进hESC来源的神经玫瑰花环结构（位于神经球内）的增殖。
      注意：第11天时，大多数细胞应呈Nestin阳性。
   3. 第11-13天：在补充了0.5 µM BMP抑制剂的B27培养基中培养神经球。
   4. 第13-21天：在B27培养基中补充10 ng/mL胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）、10 ng/mL脑源性神经营养因子（BDNF）和1 µM γ-分泌酶抑制剂进行培养。GDNF和BDNF可促进神经元和胶质细胞的分化，而γ-分泌酶抑制剂有助于提高神经成熟度。
   5. 第21天，将神经球（约1000个）接种于置于6孔板培养插件上的亲水性聚四氟乙烯（PTFE）膜（直径6 mm，孔径0.4 µm）上。自此步骤起停止旋转培养。在明场显微镜下观察到玫瑰花环样结构，表明神经分化已启动。神经玫瑰花环结构通常在神经球接种至PTFE膜后2-3天内可见。
   6. 此后3周的分化期间，每隔2-3天（通常为周一、周三、周五），在膜插件下方的每孔中加入1 mL含生长因子和抑制剂（如下所述）的B27培养基。
   7. 第21-25天：在相同的神经成熟培养基中培养人类神经类器官。
   8. 第25-28天：仅在B27培养基中补充1 µM γ-分泌酶抑制剂。
   9. 第28-39天：停止添加γ-分泌酶抑制剂，仅使用B27培养基继续培养人类神经类器官。
      注意：3周后，神经类器官即可用于GIC移植。在神经成熟过程中，可观察到未成熟神经标志物Nestin表达减少，而成熟神经标志物β3-微管蛋白和GFAP表达增加。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6孔板 (6-well plate)	Falcon / Corning	07-201-588
Aggrewell 400 (微孔培养板)	StemCell Technologies	34421
B27添加剂 (B27)	Life Technologies / Invitrogen	1238	两种方案均使用，储存液为100倍浓度，终浓度为1倍
脑源性神经营养因子  (BDNF)	Cell Guidance	GFH1-2	两种方案均使用，  储存液为100 µg/mL（纯H2O中），终浓度为20 ng/mL
Compound E（γ-分泌酶抑制剂）(γ–secretase inhibitor)	Calbiochem	CAS 209986-17-4	两种方案均使用（gamma-secretase inhibitor XXI），  储存液为5 mM（DMSO中），终浓度为1 µM
纯二甲基亚砜 (DMSO)	Sigma-Aldrich	C6164	化合物溶剂，可直接使用
杜尔贝科改良伊格尔培养基 (DMEM)	Life Technologies	12491-015	用于细胞培养，可直接使用
杜尔贝科改良伊格尔培养基/F-12混合物 (DMEM-F12)	Gibco	11320033	用于细胞培养，可直接使用
EDTA 0.1 mM (EDTA)	Life Technologies	AM9912	用于细胞培养，可直接使用
胶质细胞源性神经营养因子 (GDNF)	Cell Guidance	GFH2-2	两种方案均使用，  储存液为100 µg/mL（纯H2O中），终浓度为20 ng/mL
亲水性聚四氟乙烯  膜 (PTFE膜)	BioCell-Interface	已停产
LDN-193189 (BMP抑制剂)	Axon Medchem /Stemgen	04-0072-02 /1509	Dual/Smad抑制，  储存液为5 mM（DMSO中），终浓度为0.5 µM
L-谷氨酰胺 (L-glutamine)	Gibco	25030081	L-谷氨酰胺 (200 mM)，储存液为200 mM，终浓度为2 mM
Matrigel (细胞外基质)	BD Biosciences	354277	适用于人胚胎干细胞的基质，储存液浓度为18–22 mg/mL，终浓度为180–220 µg/mL
Millicell-CM培养板插件  (0.4 µm) (培养板插件)	Millipore	PICM03050
单克隆抗β-微管蛋白III抗体	Sigma	T8660	1/1000稀释
MS轨道摇床，MS-NOR-30 (轨道摇床)	Major Science	MS-NRC-30
Neurobasal (Neurobasal)	Life Technologies / Gibco	21103049	用于维持和成熟胚胎神经元细胞群体，可直接使用
非必需氨基酸  (NEAA)	Gibco	11140	非必需氨基酸100倍液，储存液为100x，终浓度为1x
Nurr1抗体 (M-196)	Santa Cruz	Sc-5568	1/100稀释
Nutristem  (hESC培养基)	Biological Industries	05-100-1A	干细胞培养基，可直接使用
青霉素/链霉素  (Penicilin / Streptomycin )	Life Technologies / Gibco	15140122	用于细胞培养，储存液为5 mg/mL，终浓度为50 µg/mL
不含Ca²⁺/Mg²⁺的磷酸盐缓冲液  (PBS without Ca²⁺/Mg²⁺)	Life Technologies	14190250	用于细胞培养，可直接使用
Rho相关激酶抑制剂 Y-27632 (ROCK)	Abcam Biochemicals	ab120129-1	ROCK抑制剂，  储存液为50 mM（DMSO中），终浓度为10 µM
SB-431542 (TGFβ/Activin/Nodal抑制剂)	Ascent	Asc- 163	Dual-Smad抑制，  储存液为50 mM（DMSO中），终浓度为10 µM
StemPro Accutase (hESC酶解液)	Gibco	A11105-01	hESC酶解液，可直接使用
T150培养瓶 (T150 flask)	Falcon	08-772-1F
转化生长因子β3 (TGFβ3)	Cell Guidance	GFH109-2	用于多巴胺能分化方案，  储存液为100 µg/mL（纯乙醇中），终浓度为1 ng/mL
0.25%胰蛋白酶 (酶解液)	Life Technologies	15050065	酶解液，可直接使用
X-vivo (无血清培养基)	Lonza	BE04-743Q	无血清培养基，可直接使用