来源：Cosset, E. 等。用于研究脑癌与神经退行性疾病的类人神经类器官。J. Vis. Exp. (2019)
本视频展示了将人胚胎干细胞（hESCs）分化为多巴胺能神经元的过程，以提供研究帕金森病的模型。将hESCs在微孔板中的神经诱导培养基中培养，形成三维神经球。随后在神经诱导培养基中继续培养，以促进其分化为多巴胺能前体神经元。最终神经元的成熟过程在培养小室中的气液界面条件下进行，从而形成由成熟多巴胺能神经元组成的三维类器官。
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由人胚胎干细胞生成多巴胺能神经元类器官
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
1. 用于帕金森病（PD）研究的人胚胎干细胞衍生多巴胺能类器官
- 第0天：将人胚胎干细胞（hESCs）在二维培养中扩增至约60%融合度（第0天），随后将维持hESCs多能性特征的干细胞培养基更换为无血清培养基。通过在培养基中添加0.5 µM骨形态发生蛋白（BMP）抑制剂和10 µM转化生长因子β（TGFβ）/Activin/Nodal抑制剂（双SMAD抑制剂组合）启动神经诱导，并加入10 µM Rho相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂处理24小时，以提高细胞传代过程中的存活率。
- 第1天：在微孔板中每孔加入2.5 mL无血清培养基，其中添加0.5 µM BMP抑制剂、10 µM TGFβ/Activin/Nodal抑制剂和10 µM ROCK抑制剂。为诱导细胞向神经管腹侧模式特化，额外加入100 ng/mL sonic hedgehog（SHH）、100 ng/mL成纤维细胞生长因子8（FGF8）和2 µM smoothened激动剂。将该微孔板（仅含培养基，不含细胞）以1200 x g 离心5分钟，以去除微孔中的气泡。
- 在二维条件下进行神经诱导1天后，移除培养基，并用不含Ca2+/MgCl2+的磷酸盐缓冲液（PBS）快速洗涤。在T75 cm2 培养瓶中加入7.5 mL重组酶溶液，将细胞集落消化为单细胞悬液。于37 °C孵育2分钟，随后加入7.5 mL DMEM/F12培养基终止消化。
- 收集细胞悬液，以300 x g 离心5分钟。弃上清，用配制微孔板所用的相同培养基重悬并计数细胞。
- 调整培养基体积，使细胞悬液浓度可形成每微孔含1000个细胞的神经球（例如，本实验所用微孔板每孔含4,700个微孔）。因此，在2.5 mL培养基中准备470万个细胞，并将其加入此前已置于微孔板中的2.5 mL培养基中。
- 为使细胞均匀分布至各微孔，轻轻振荡微孔板，并以300 x g 离心5分钟。将微孔板置于37 °C培养24小时以形成神经球。
- 第2天：用培养基轻柔冲洗微孔，收集神经球并转移至经组织培养处理的六孔板中。更换为Neurobasal培养基，其中添加1% B27、1×非必需氨基酸（NEAA）、2 mM L-谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素。此外，继续添加区域化因子SHH、FGF8、smoothened激动剂以及双SMAD抑制小分子。
- 将神经球置于37 °C旋转培养（60 rpm，轨道摇床），每2–3天更换一半新鲜添加上述因子的培养基。
- 第3天：为增强神经诱导并促使神经前体细胞获得中脑特性，在培养基中添加3 µM糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）抑制剂，以激活Wnt/β-catenin信号通路。自第3天起持续在培养基中维持GSK-3β抑制剂至第13天。将细胞分至两个新的组织培养处理六孔板中，以降低每孔神经球密度，避免神经球聚集。
注意：至第8天时，大多数细胞应呈Nestin阳性。 - 第8天：开始神经成熟阶段：将区域化因子SHH、FGF8、smoothened激动剂及双SMAD抑制剂组合替换为0.5 mM二丁酰环磷酸腺苷（cAMP）（促进成熟）、20 nM组蛋白去乙酰化酶抑制剂（促进细胞周期退出）、1 µM γ-分泌酶抑制剂，以及生长因子：10 ng/mL胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）、10 ng/mL脑源性神经营养因子（BDNF）、1 ng/mL转化生长因子β3（TGFβ3）和5 ng/mL成纤维细胞生长因子20（FGF20）（均有利于多巴胺能[DA]前体细胞的存活）。每2–3天更换一次培养基。
- 第21天：生成神经类器官：将约100个神经球接种于聚四氟乙烯（PTFE膜，直径6 mm）上，置于气液界面条件下。将膜转移至培养板插入物（0.4 mm）中，并加入1.2 mL此前用于神经球分化的神经成熟培养基。
- 自本步骤起停止任何旋转培养。每2–3天更换一次培养基，直至达到所需的分化时间点。
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披露
未声明任何利益冲突。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 6孔板（6-well plate） | Falcon / Corning | 07-201-588 | |
| Aggrewell 400（微孔培养板） | StemCell Technologies | 34421 | |
| B27添加剂（B27） | Life Technologies / Invitrogen | 1238 | 两种方案均适用，储存液为100倍浓度，工作液为1倍浓度 |
| 脑源性神经营养因子（BDNF） | Cell Guidance | GFH1-2 | 两种方案均适用， 储存液为100 µg/mL纯H2O溶液，工作液为20 ng/mL |
| CHIR-99021（GSK-3β抑制剂） | Axon Medchem | ct99021 | 多巴胺能分化方案专用， 储存液为7.5 mM DMSO溶液，工作液为3 µM |
| Compound E（γ-分泌酶抑制剂） | Calbiochem | CAS 209986-17-4 | 两种方案均适用（γ-分泌酶抑制剂XXI）， 储存液为5 mM DMSO溶液，工作液为1 µM |
| 二丁酰环磷酸腺苷（Dibutyryl cAMP） | Sigma | D0627 | 多巴胺能分化方案专用， 储存液为0.5 M DMSO溶液，工作液为0.5 mM |
| DMEM/F12培养基（DMEM-F12） | Gibco | 11320033 | 用于细胞培养，即用型 |
| EDTA 0.1 mM（EDTA） | Life Technologies | AM9912 | 用于细胞培养，即用型 |
| 成纤维细胞生长因子20（FGF20） | Peprotech | 100-41 | 多巴胺能分化方案专用， 储存液为100 µg/mL纯H2O溶液，工作液为5 ng/mL |
| 成纤维细胞生长因子8 （FGF8） | Peprotech | GFH176-5 | 多巴胺能分化方案专用， 储存液为100 µg/mL纯H2O溶液，工作液为100 ng/mL |
| 胶质细胞源性神经营养因子（GDNF） | Cell Guidance | GFH2-2 | 两种方案均适用， 储存液为100 µg/mL纯H2O溶液，工作液为20 ng/mL |
| 亲水性聚四氟乙烯膜（PTFE膜） | BioCell-Interface | 已停产 | |
| LDN-193189（BMP抑制剂） | Axon Medchem /Stemgen | 04-0072-02 /1509 | Dual/Smad抑制， 储存液为5 mM DMSO溶液，工作液为0.5 µM |
| L-谷氨酰胺（L-glutamine） | Gibco | 25030081 | L-谷氨酰胺（200 mM），储存液为200 mM，工作液为2 mM |
| Millicell-CM培养板插件（0.4 µm）（培养板插件） | Millipore | PICM03050 | |
| MS轨道摇床，MS-NOR-30（轨道摇床） | Major Science | MS-NRC-30 | |
| N2添加剂（N2） | Invitrogen | 17502-048 | 用于GIC培养，储存液为100倍浓度，工作液为1倍浓度 |
| Neurobasal培养基（Neurobasal） | Life Technologies / Gibco | 21103049 | 用于维持和成熟胚胎神经元细胞群体，即用型 |
| 非必需氨基酸（NEAA） | Gibco | 11140 | 非必需氨基酸100X，储存液为100倍浓度，工作液为1倍浓度 |
| Nutristem （hESC培养基） | Biological Industries | 05-100-1A | 干细胞培养基，即用型 |
| 青霉素/链霉素 （Penicilin / Streptomycin） | Life Technologies / Gibco | 15140122 | 用于细胞培养，储存液为5 mg/mL，工作液为50 µg/mL |
| 不含Ca²⁺/Mg²⁺的磷酸盐缓冲液 （PBS without Ca²⁺/ Mg²⁺） | Life Technologies | 14190250 | 用于细胞培养，即用型 |
| Purmorphamin（smoothened激动剂） | Calbiochem | SML0868 | 多巴胺能分化方案专用， 储存液为10 mM DMSO溶液，工作液为2 µM |
| Rho相关激酶Y-27632（ROCK） | Abcam Biochemicals | ab120129-1 | ROCK抑制剂， 储存液为50 mM DMSO溶液，工作液为10 µM |
| SB-431542（TGFβ/Activin/Nodal抑制剂） | Ascent | Asc- 163 | Dual-Smad抑制， 储存液为50 mM DMSO溶液，工作液为10 µM |
| 音猬因子（SHH） | Cell Guidance | GFH168-5 | 多巴胺能分化方案专用， 储存液为100 µg/mL纯H2O溶液，工作液为100 ng/mL |
| StemPro Accutase（hESC酶解液） | Gibco | A11105-01 | hESC酶解液，即用型 |
| T150培养瓶（T150 flask） | Falcon | 08-772-1F | |
| 转化生长因子β3（TGFβ3） | Cell Guidance | GFH109-2 | 多巴胺能分化方案专用，储存液为100 µg/mL纯乙醇溶液，工作液为1 ng/mL |
| 曲古抑菌素A（组蛋白去乙酰化酶抑制剂） | Sigma | T8552 | 多巴胺能分化方案专用， 储存液为100 µM DMSO溶液，工作液为20 nM |
| TrypLE（重组酶解液） | Invitrogen | 12604021 | 重组酶解液，即用型 |
| 0.25%胰蛋白酶（酶解液） | Life Technologies | 15050065 | 酶解液，即用型 |
| X-vivo（无血清培养基） | Lonza | BE04-743Q | 无血清培养基，即用型 |
