使用撞击探针建立小鼠创伤性脑损伤模型

摘要

来源：Furmanski, O., 等. 小鼠脑损伤的可控皮层撞击模型及人诱导多能干细胞衍生神经细胞的治疗性移植。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频演示了通过开颅方式在小鼠中诱导创伤性脑损伤的操作步骤：沿颅骨中线做切口，钻透颅骨并移除骨瓣以暴露脑皮层，施加高压以造成损伤。随后缝合伤口，制备可用于后续实验的小鼠模型。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 开颅术与控制性皮质冲击

1. 准备可控皮层撞击装置和手术用品。
   1. 用1 mL无菌生理盐水填充一支滑动式针筒，体积为0.5 mL，用于伤口冲洗。在针筒上安装25 G针头以控制冲洗过程。
   2. 将环孢素A（CsA）溶于二甲基亚砜（DMSO）中，配制成终浓度为1 mg/mL的稀释溶液。用另一支1 mL滑动式针筒吸取0.5 mL CsA溶液，用于免疫抑制。在CsA针筒上安装25 G或更大规格的针头。
   3. 将可控皮层撞击活塞连接至立体定位仪的臂上，并将其设置为15°角。将一个直径为3 mm的撞击探针连接至活塞上。
   4. 将撞击速度设定为1.5 m/s，撞击停留时间设定为0.1 s，以产生轻度皮层损伤。
2. 进行单侧开颅术
   1. 将小鼠放入与异氟烷蒸发器相连的麻醉诱导室中，氧气源为压缩氧气。使用约3%异氟烷和约0.7 L/min氧气进行麻醉诱导。通过脚趾夹捏无反应来判断麻醉深度。
   2. 使用电动剪刀剃除头皮毛发，并用棉签清除松散的毛发。
   3. 将小鼠固定于配备麻醉气体输送鼻罩的立体定位仪上。
      1. 在立体定位仪上放置一个37 °C加热垫，置于小鼠下方，以维持麻醉期间的体温。使用耳杆和咬合杆固定头部，并调整头部方向，使颅骨额骨保持水平。手术全程维持异氟烷浓度在约1.5%-2%之间。
   4. 进行术前护理和无菌手术准备：使用无菌棉签将抗生素眼膏涂抹于眼睛表面。用含碘溶液涂抹已剃毛的头皮区域，随后用70%乙醇擦拭去除。用带孔手术巾覆盖动物身体，仅暴露头部顶部，同时遮盖眼睛。
   5. 使用手术刀或剪刀在头皮正中线处做一长度为1.5–2 cm的切口。使用无菌棉签清洁伤口，并清除冠状缝前方中线左侧的筋膜组织。
   6. 使用撞击探针确定开颅位置。
      1. 将立体定位参考点（X = 0, Y = 0）设为前囟点。将探针横向移动至中线左侧2 mm处。使用细尖外科安全标记笔围绕探针画出一个直径为5 mm的圆圈。抬起并旋转撞击探针使其离开原位。
   7. 使用高速旋转微型电机套件的手持工具，配合圆头0.6 mm或0.8 mm钻头，在约70%-80%最大转速下在颅骨上钻出开口。钻孔时沿5 mm周向轮廓施加轻压，以减薄该边缘区域。
      1. 钻孔时切勿施加过大的压力。振动、压迫或意外穿透可能导致皮层损伤。应依靠钻头的转速完成切割工作。
      2. 避免在同一位置持续钻孔过久，以防因摩擦产生过多热量。在钻孔过程中应定期用无菌生理盐水冲洗开颅区域，以清除碎屑并降低旋转工具产生的热量。
      3. 钻至冠状缝线区域时需格外小心，因为这些部位容易发生出血。
   8. 当开颅轮廓区域已充分变薄后，使用精细镊子移除颅骨瓣。从内侧夹住骨瓣，以径向动作轻轻提起并向外侧拉出。
      1. 抬起骨瓣时切勿损伤硬脑膜，否则可能导致严重损伤和出血。
3. 实施轻度可控皮层撞击损伤
   1. 使用无菌酒精棉片清洁撞击探针。将撞击探针重新移至暴露的皮层上方位置。降低探针直至接触硬脑膜表面。将此位置标记为Z = 0。
   2. 回撤活塞至Z = -1.0 mm位置，然后释放活塞以撞击皮层。 

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 ml 注射器	Becton Dickinson (BD)	309659
25G Precision Glide 注射器针头	Becton Dickinson (BD)	305122
麻醉蒸发器	Vetland	0521-11-22
动物操作布			从百货商店购买
Betadine	Purdue Products	NDC-67618-151-32
压缩氧气			根据地区选择合适产品
环孢素 A	Sigma-Aldrich	30024-100mg
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma-Aldrich	D8418-500ml
DMEM	Invitrogen (ThermoFisher)	A14430-01
精细镊子	Fine Science Tools	11254-20
镊子	Fine Science Tools	91106-12
高速旋转微型电机套件	Foredom Electric Co.	K.1070 - K.107018
理想型微型钻头套装（5件）	Cell Point Scientific	60-1000
CCI 用 Impact One 立体定位撞击器	Leica Biosystems	39463920
眼科软膏	Falcon Pharmaceuticals	NDC-61314-631-36
小型啮齿类动物立体定位仪	Stoelting	51925
小型剪刀	Fine Science Tools	14060-09
无菌酒精棉片	Fisherbrand	06-669-62
无菌棉签/Kendall Q-tips	Tyco Healthcare	540500
无菌生理盐水	Hospira	NDC-0409-1966-07
缝合线 — 5.0 丝线带弯曲针	Oasis	MV-682