利用电刺激在大鼠模型中诱导急性脑桥梗死

摘要

来源：Luo, M., 等. 通过电刺激建立大鼠急性脑桥梗死模型. 视觉化实验杂志 (2020)

本视频演示了通过电刺激在麻醉大鼠的脑桥中诱导组织损伤或梗死的操作步骤。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 脑桥梗死模型的建立

1. 在麻醉前立即预热加热垫。
2. 将颅骨钻安装到立体定位仪支架上的固定夹中。
3. 腹腔注射给予大鼠氯胺酮（50 mg/kg）和赛拉嗪（5 mg/kg）。通过夹趾反应测试确认麻醉深度。
4. 将大鼠以俯卧位固定于立体定位仪上，将耳杆置于耳道上方以固定头部。确保颅骨保持水平，以避免注射位置偏移。
5. 通过带有进气和出气口的立体定位鼻罩，使用异氟烷（100% 氧气，2.5% 异氟烷）维持麻醉。使用加热垫将体温维持在 37 °C，并在整个手术过程中持续监测。
6. 使用眼膏防止角膜干燥。使用镊子轻夹足爪，确认无疼痛反应。
7. 使用微型剃毛器剃除颅骨部位的毛发。以手术切口为中心，使用氯己定外科洗手液由内向外环形擦拭消毒。
8. 使用手术刀从双侧外眦连线至后囟后 0.5 cm 处做一条 3 cm 长的正中切口，该位置应事先用细头黑色手术标记笔标出。
9. 使用棉签清除血液。
10. 在皮瓣两侧各贴一条手术胶带，以充分暴露颅骨表面（图 1）。
11. 用浸有 0.9% NaCl 的棉签轻轻去除颅骨表面的结缔组织。若未清除，结缔组织可能缠绕在钻头上。
12. 确定前囟位置。以前囟中心点为原点，使用细头黑色手术标记笔进行标记。
13. 将钻头置于前囟后 6.0 mm、内侧 2.0 mm 处（范围为 0.5–3.0 mm，图 2A）。
14. 使用自动钻头进行开颅（直径 1 mm）。操作需谨慎，因该位置靠近静脉窦。
15. 将钻头从立体定位仪上取下。
16. 将一根带绝缘鞘的 22 G 探针安装至立体定位仪上（图 3A）。探针尖端应位于鞘管近端上方 2 mm 处（图 3A, B；图 2B）。
17. 确保鞘管进入脑组织深度为 7 mm（7 mm DV，图 2B；图 1C）。
18. 沿鞘管推进探针（图 1D），直至探针尖端到达脑表面下 9 mm 处（图 2D）。
19. 将电极连接至电刺激器（图 3C）。将阳极连接至探针，如 图 1D 所示；将阴极连接至大鼠（通常连接至大鼠耳部）。
20. 开启电刺激器，并设置以下参数：单脉冲宽度 = 4,050 ms；电压 = 50 V；电流 = 4 mA（图 3C）。电刺激期间，大鼠会出现颤抖。本研究中，用于行为学测试、MRI 和 TTC 检测的对照组大鼠不开启该设备。
21. 刺激结束后保持探针原位 5 分钟。
22. 将探针从脑组织中取出（图 1F）。
23. 使用骨水泥覆盖开颅部位。在缝合伤口前，等待水泥完全干燥。
24. 使用 4-0 聚酰胺缝线缝合伤口。每缝合三到四针后，打 2-1-1 标准外科结。
25. 腹腔注射青霉素（0.25 mL，80 IU 溶于 4 mL 生理盐水中）以预防感染。
26. 皮下注射美洛昔康（2 mg/kg），之后每 24 小时重复一次。
27. 每 15 分钟监测一次大鼠状态，直至其完全清醒，然后将其放回带有加热垫的笼中。提供自由摄食和饮水，直至实验终点。
    注意：所有操作均应遵循无菌手术原则。术前应进行手部外科消毒，并穿戴刷手服、外科口罩和无菌手套。缝合材料应始终保持在无菌区域内。

结果

图1：梗死模型的建立。 (A) 颅骨上钻孔。(B) 将套管移至孔洞处。(C) 注射套管。(D) 插入探针。(E) 连接阳极（红色箭头）。(F) 移除探针。(G) 脑表面残留的孔洞（红色箭头）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4-0 吸引线	Shanghai Jinzhong		外科器械
医用胶带	Shanghai Jinzhong		外科器械
动物麻醉系统	RWD		使用该系统时需佩戴面罩
骨水泥	Shanghai Jinzhong		外科器械
固定夹	Shanghai Jinzhong		外科器械
普通组织剪	Shanghai Jinzhong		外科器械
IndoPhors	国药集团		消毒灭菌
Isoflurane	RWD	217181101
病灶制作装置	上海玉研		用于制造病灶
MRI 系统	Bruker Biospin		活体梗死确认
持针器	Shanghai Jinzhong		外科器械
青霉素	国药集团		感染预防
探针	Anke		需要进行一些改装
棉签	Shanghai Jinzhong		外科器械
剪刀	Shanghai Jinzhong		外科器械
立体定位仪	RWD
缝合针	Shanghai Jinzhong		外科器械
组织固定镊	Shanghai Jinzhong		外科器械
TTC	Sigma-Aldrich	BCBW5177	用于体外梗死确认