建立斑马鱼幼体药物诱导出血模型

摘要

来源：Crilly, S.，等。利用斑马鱼幼体研究出血性脑卒中的病理后果。J. Vis. Exp. (2019)

在本视频中，受精的斑马鱼胚胎在体视显微镜下进行去壳处理，随后暴露于胆固醇合成抑制剂中，导致幼鱼出现血管破裂和脑出血。通过显微镜观察，可根据明显的红色斑点识别出血性幼鱼，并将其分离以进行后续分析。

方案

注意： 本研究使用的转基因品系包括巨噬细胞特异性谱系 mpeg1:mCherry（实验室自行构建）、中性粒细胞特异性 mpo: GFP、红系特异性 gata1:dsRed，以及细胞死亡报告基因 ubiq:secAnnexinV-mVenus（实验室重新构建），以上品系均构建于野生型、nacre（mitfa^w2/w2）和突变型（bbh^m292）背景上。

1. 第0天：卵的产生与收集

1. 从由1条雄性成年斑马鱼和1-2条雌性成年斑马鱼在繁殖盒中自然交配产生的受精卵中收集胚胎。
   注意：在阿托伐他汀实验方案中，可使用任何野生型或转基因品系动物；但不同品系之间的出血率略有差异。
2. 每皿将100个胚胎置于标准E3胚胎培养液中，在28 °C条件下孵育，并根据标准指南确定胚胎发育阶段。
3. 受精后约6小时（hpf），使用巴斯德移液管从培养皿中移除死亡和未受精的胚胎。图1显示了实验时间线。

2. 第1天：24 hpf时阿托伐他汀处理

1. 使用锋利的超细解剖镊去除胚胎的 chorion，以进行阿托伐他汀处理。实验所需数量可根据实际情况调整。
2. 向两个洁净的培养皿中各加入 30 mL E3 胚胎培养基。其中一个培养皿用于放置 100 个胚胎。
   注意：如果使用的是细胞培养板，此早期阶段的去壳斑马鱼胚胎常会粘附于底部。为避免此现象，使用前需用洁净水彻底冲洗培养板。
3. 从处理组培养板中移除 60 µL 胚胎培养液，并加入 60 µL 0.5 mM 阿托伐他汀（ATV）。当原液浓度为 0.5 mM 时，上述稀释操作将获得 1 µM 的终浓度，导致约 20% 的幼鱼无出血（ICH-），约 80% 的幼鱼出现脑内出血（ICH+）。另一培养板作为未处理对照组使用。
   注意：阿托伐他汀溶于蒸馏水（3 mg 溶于 10 mL）配制成 0.5 mM 储存液。需在室温避光条件下震荡孵育过夜，因溶解过程较慢，完全溶解可能需要长达 1 周时间。切勿使用 DMSO（二甲基亚砜）。溶液分装后储存于 -20°C，避免反复冻融。
4. 使用巴斯德吸管，将 100 个胚胎连同尽可能少的液体转移至处理组培养板中。
5. 将培养板在 28 °C 条件下孵育。
   注意：脑内出血（ICH）将在 33 至 48 hpf 之间发生。阿托伐他汀无需移除，因孵育时间超过 24 小时不会引起额外的发育问题。

第3天：在50 hpf时分离ICH-和ICH+群体

1. 将 ICH+ 鱼与 ICH- 种群分离，并转移至新的培养皿中以便操作。
   1. 若使用 ATV 模型且阿托伐他汀浓度为 1 µM，此时将有 75–100% 的幼鱼出现出血（ICH+）。
      注意： 不同品系幼鱼的反应存在差异；若幼鱼出血频率未达预期，建议使用新一批次的阿托伐他汀或提高药物浓度。若幼鱼在 48 hpf 时仍未出现出血，则视为 ICH-。
   2. 若使用 bbh 模型，所有纯合突变体将在 48 hpf 前出现出血。若使用杂合子互交，则可将未出血的杂合子及野生型同胞作为实验对照动物。
2. 必要时，通过向 E3 培养基中添加 0.02% MS222 对幼鱼进行麻醉。使用巴氏吸管将头部有血液的幼鱼挑选出来，转移至新鲜的 E3 培养基中。参见图 2。
   注意： 头部出血可能出现在前脑、中脑或后脑，也可能同时出现在多个区域，且不同个体间的出血量可能存在差异。在 bbh 突变体中，颅内出血常伴随严重水肿，表现为头部较大、眼间距增宽以及出血区域更弥散。然而，并非所有 ICH+ 的 bbh 幼鱼均表现出水肿。

结果

图1： 实验时间线示意图，用于表征脑损伤、运动功能及神经炎症结果。ICH，脑内出血；bbh，bubblehead。

图 2： ICH+ 脑出血表型。在转基因 gata1:DsRed 报告基因的 n...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
24孔板	Sigma-Aldrich	CLS3527
28 °C 培养箱	LMS	210
阿托伐他汀	Sigma-Aldrich	PZ0001-5mg
繁殖盒	Thoren Aquatics systems	10011
Daniovision 观察室	Noldus	n/a
1x E3 培养基			4% Instant Ocean，1 L dH2O 中含 500 µL 亚甲蓝
EthoVision XT 软件	Noldus	version 11
Instant ocean	Instant Ocean	SS15-10
显微镜	Leica	MZ95	解剖显微镜
P1000 移液器	Gilson	F144059M
P1000 移液器吸头	Starlab	S1122-1830
巴斯德吸管	Starlab	E1414-0300
培养皿	Corning	101VR20
Pipetboy	Integra Biosciences	PIPETBOY
超细解剖镊	Agar scientific	AGT502
Zen 软件	Zeiss	version 2.3