神经前体细胞和神经元中唾液酸糖蛋白的免疫荧光染色

摘要

来源：Bai, Q., 等., 通过唾液酸糖代谢标记鉴定原代神经干细胞与祖细胞的细胞表面标志物 J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了在原代神经干细胞和祖细胞以及神经元中，对修饰的唾液酸糖蛋白进行生物素化和荧光标记，并利用荧光显微镜进行可视化观察。

方案

1. 扩增的原代NSPCs及分化神经元中唾液酸化糖蛋白的免疫荧光染色

1. 配制含有1.5 mM CuSO₄ 和9 mM BTTAA的BTTAA-CuSO₄复合物1 30倍浓缩液，溶于双蒸水中。新鲜配制含50 µM生物素-炔烃、2.5 mM抗坏血酸钠及1倍BTTAA-CuSO₄复合物的生物素偶联缓冲液1，溶于PBS中。
2. 从共培养板中取出插入物。吸除底部孔中的培养基，并用预热的PBS洗涤神经细胞一次。
3. 吸除孔中的PBS。每孔加入1 mL预冷的含4%多聚甲醛的PBS溶液，室温固定细胞10分钟。随后用预冷的PBS洗涤细胞3次。
4. 吸除孔中的PBS。每孔加入1 mL新鲜配制的生物素偶联缓冲液1，室温孵育10分钟。
5. 吸除反应缓冲液。用PBS洗涤细胞3次。配制含1% FBS和1 µg/mL Alexa Fluor 647标记链霉亲和素的染色缓冲液。每孔加入1 mL染色缓冲液，室温孵育30分钟。
6. 吸除染色缓冲液，用预冷的PBS洗涤细胞3次。配制含5% BSA和0.3%非离子去垢剂-100的封闭缓冲液（溶于PBS）。每孔加入1 mL封闭缓冲液，室温孵育10分钟。
7. 将抗nestin抗体和抗β-tubulin III抗体按1:20和1:1,000的比例同时稀释于封闭缓冲液中，配制一抗溶液。吸除孔中封闭缓冲液，每孔加入1 mL一抗溶液，4 °C孵育过夜。
8. 吸除一抗溶液。用预冷的PBS洗涤细胞3次。将Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠IgG1、Alexa Fluor 546标记的山羊抗小鼠IgG2b以及DAPI按1:1,000比例共同稀释于封闭缓冲液中，配制二抗溶液。吸除孔中PBS，每孔加入1 mL二抗溶液，室温孵育2小时。
9. 吸除抗体溶液，用预冷的PBS洗涤细胞3次。此后，细胞即可用于成像。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胎牛血清	Gibco	10099141	10%
多聚甲醛	Sigma	158127	4%
DAPI	Gibco	62248
6孔板	Corning	3335
小鼠单克隆抗Nestin抗体	发育研究杂交瘤库	Rat-401	1:20
小鼠单克隆抗β-微管蛋白III抗体	Sigma	T8860	1:1000
Alexa Fluor 488 标记的山羊抗小鼠IgG1	Invitrogen	A-21121	1:1000
Alexa Fluor 546 标记的山羊抗小鼠IgG2b	Invitrogen	A-21143	1:1000
吐温X-100	Amresco	694
硫酸铜	Sigma	209198
炔基生物素	Click Chemistry Tools	TA105
BTTAA	Click Chemistry Tools	1236
抗坏血酸钠	Sigma	A4034
Alexa Fluor 647 标记的链霉亲和素	Invitrogen	S21374	1:1000