来源：Kuboyama, T. 在培养的小鼠神经元中可视化轴突生长锥塌陷及早期淀粉样β蛋白效应。J. Vis. Exp. (2018)
本视频演示了由β-淀粉样蛋白（Aβ）聚集体诱导的神经元生长锥塌陷的体外评估方法。用Aβ聚集体处理神经元会导致细胞骨架失稳，进而引起轴突末端生长锥的塌陷。通过将处理后的细胞与对照细胞进行比较，以评估生长锥塌陷的程度。
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方法文章
体外评估聚集性淀粉样蛋白-β对神经元生长锥塌陷的影响
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
1. 塌陷实验
- 多聚-D-赖氨酸包被
- 用 400 μL 含 5 μg/mL 多聚-D-赖氨酸（PDL）的磷酸盐缓冲液（PBS）包被 8 孔培养板，于 37 °C 孵育过夜。
- 吸除 PDL 溶液，用蒸馏水洗涤各孔 3 次。
- 神经元培养
- 用显微剪刀将胚胎第 14 天（E14）ddY（Deutschland, Denken, 和 Yoken）小鼠新鲜分离的大脑皮层在含 12% 马血清、0.6% 葡萄糖和 2 mM L-谷氨酰胺（培养基 A）的神经元培养基中剪碎。不要添加抗生素。
注意：本方案使用 ddY 小鼠，这是一种在日本常用的远交品系。本神经元培养方案也可用于大鼠皮层神经元。 - 以 87 × g 离心组织 3 分钟。
- 吸除上清液，向沉淀中加入 2 mL 0.05% 胰蛋白酶，于 37 °C 孵育 15 分钟。每 5 分钟轻敲混匀一次。
- 加入 4 mL 培养基 A，轻敲混匀。
- 以 178 × g 离心组织 3 分钟。
- 吸除上清液，将组织与含 600 U/mL 脱氧核糖核酸酶 I（DNase I）和 0.3 mg/mL 大豆胰蛋白酶抑制剂的 PBS 溶液于 37 °C 孵育 15 分钟。每 5 分钟轻敲混匀一次。
- 孵育后，加入 4 mL 培养基 A，轻敲混匀。
- 以 178 × g 离心组织 3 分钟。
- 吸除上清液后，加入 4 mL 培养基 A，用抛光的巴斯德移液管吹打组织。
- 用孔径为 70 µm 的滤网过滤吹打后的组织。过滤后，用血细胞计数板计算细胞密度。
- 将细胞以每孔 0.8 × 104 个细胞的密度接种于 8 孔培养板中，使用培养基 A 培养，并置于含 10% CO2 的湿润环境中，于 37 °C CO2 培养箱中维持培养。
- 培养 4 小时后，更换为含 2% 神经元培养添加剂、0.6% 葡萄糖和 2 mM L-谷氨酰胺（培养基 B）的新鲜培养基。
注意：神经元纯度约为 75%，如先前所述。
- 用显微剪刀将胚胎第 14 天（E14）ddY（Deutschland, Denken, 和 Yoken）小鼠新鲜分离的大脑皮层在含 12% 马血清、0.6% 葡萄糖和 2 mM L-谷氨酰胺（培养基 A）的神经元培养基中剪碎。不要添加抗生素。
- 生长锥塌陷实验
- 将市售的全长淀粉样蛋白 β1-42（Aβ1-42）溶于蒸馏水中，配制成 0.5 mM 的溶液，于 37 °C 孵育 7 天。孵育结束后，将聚集的 Aβ1-42 溶液储存于 -30 °C 冰箱中备用。
注意：该孵育步骤对 Aβ 的聚集和毒性至关重要。 - 神经元培养 4 天后，向各孔加入含 0.5 μM 聚集 Aβ1-42 或对照溶液（蒸馏水）的新鲜培养基 B 100 μL，处理 1 小时。
注意：Aβ1-42 的效应在 0.1 至 5 μM 范围内呈剂量依赖性增加，并在 0.5 μM 时达到峰值，如先前所述。在神经元培养 3 天后进行 1 小时 Aβ1-42 处理，也可观察到类似结果。 - 吸除培养基，立即在加热板上用含 4% 蔗糖的 4% 多聚甲醛 PBS 溶液于 37 °C 固定神经元 1 小时。
- 固定后，用 PBS 洗涤神经元 3 次，然后用水溶性封片剂封片。于 4 °C 干燥封片剂 2–4 天。
- 在倒置显微镜下使用 20X 干式物镜拍摄每个孔的整个区域（7.8 × 9 mm2）。
- 根据先前描述的方法，将处于第 3 或第 4 阶段的每个神经元的最长突起归类为轴突。
- 根据以下标准对生长锥进行分类：1）缺乏片状伪足的轴突生长锥，或 2）丝状伪足少于 3 根的生长锥，均视为塌陷的生长锥，如先前所述。
注意：健康的生长锥记为 0 分；塌陷的生长锥记为 1 分。每组处理的平均塌陷评分据此计算。
- 将市售的全长淀粉样蛋白 β1-42（Aβ1-42）溶于蒸馏水中，配制成 0.5 mM 的溶液，于 37 °C 孵育 7 天。孵育结束后，将聚集的 Aβ1-42 溶液储存于 -30 °C 冰箱中备用。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| ddY 小鼠 | SLC | ||
| 八孔培养板 | Falcon | 354108 | |
| 聚D-赖氨酸 | Wako | 168-19041 | |
| 培养基，Neurobasal 培养基 | Gibco | 21103-049 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 26050-088 | |
| 葡萄糖 | Wako | 049-31165 | |
| L-谷氨酰胺 | Wako | 074-00522 | |
| 0.05% 胰蛋白酶 | Gibco | 25300-054 | |
| DNase I | Worthington | DP | |
| 大豆胰蛋白酶抑制剂 | Gibco | 17075-029 | |
| 孔径为 70 µm 的滤器，细胞筛 | Falcon | 352350 | |
| B-27 添加剂 | Gibco | 17504-044 | |
| CO2 培养箱 | Astec | SCA-165DS | |
| 淀粉样蛋白 β1-42 | Sigma-Aldrich | A9810 | |
| 多聚甲醛 | Wako | 162-16065 | |
| 蔗糖 | Wako | 196-00015 | |
| 水性封片剂，AquaPoly/Mount | polysciences | 18606-20 | |
| 倒置显微镜 A | Carl Zeiss | Axio Observer Z1 | 连接 AxioCam MRm、加热单元 XL S、CO2 模块 S1 和温控模块 S1 |
| Plan-Apochromat 20x 物镜 | Carl Zeiss | 420650-9901 |
