人脑皮层切片中β-淀粉样肽的可视化

摘要

来源：Ikegawa, M. 等. 利用基质辅助激光解吸/电离成像质谱法对人脑中β-淀粉样蛋白沉积进行可视化观察. J. Vis. Exp. (2019)

该视频演示了从阿尔茨海默病患者脑组织中制备人类大脑皮层切片的实验流程，用于通过基质辅助激光解吸/电离成像质谱技术（MALDI-IMS）分析β-淀粉样蛋白（Aβ）肽的沉积情况。实验步骤包括载玻片的准备、对组织进行处理以增强离子化效率，以及分析β-淀粉样蛋白肽的空间分布。

方案

所有涉及样本采集的程序均按照本机构的IRB指南进行。 

1. 成像质谱（IMS）组织切片的制备

1. 人尸体脑组织标本的处理
   注意：确保质谱成像（IMS）的样本制备步骤能够保持组织的原始状态。避免污染和死后变化。以下步骤至关重要。
   1. 从死后8小时内取出、处理并储存在-80 °C的脑组织中获取用于质谱成像（IMS）的人类皮层标本。采集阿尔茨海默病（AD）患者及年龄匹配对照者的枕叶皮层脑组织标本。​
2. 冷冻组织切片的制备
   1. 在冷冻切片机上切割组织切片。将导电的氧化铟锡（ITO）涂层载玻片放入冷冻切片机内。
   2. 在冷冻切片机内将-80 °C保存的尸体脑组织升温至-22 °C。
   3. 每次实验均使用新的 disposable 刀片，并始终尽量使用刀片的清洁部分。
   4. 将冷冻的尸体脑组织连同少量最佳切割温度（OCT）包埋剂（足以覆盖切片台中央区域；见 材料表）一起放置于切片台上。
   5. 选择合适的薄切条件。对于质谱成像（IMS），人脑组织切片厚度应为10–12 μm。若需同时进行质谱成像（IMS）和免疫组织化学（IHC），则从每个组织样本中切取五到六张切片。
   6. 当刀片刚开始切割组织时，转动轮子“修块”，直至整个组织表面暴露。如果切片上出现轻微条纹或撕裂，应在冷冻切片机中多等待片刻，待温度调整自动修复后再继续。在打开防卷板前，先用组织垫于下方，等待数秒。
   7. 立即将组织切片转移至载玻片的ITO涂层一侧。通过将手指置于非ITO涂层一侧的载玻片下方使组织轻微解冻，使其牢固贴附于载玻片上；确保组织尽可能平整，无皱褶。此步骤应在室温下进行。
      注意：由于人类样本可能含有生物污染物，操作时应佩戴手套、口罩和实验服。当日所有切片完成后，使用实验室擦拭纸和200 mL 100%乙醇清洁冷冻切片机、刷子和夹具。
3. 组织切片的漂洗
   1. 将样本浸入40–100 mL 70%乙醇中30秒，以去除内源性脂质和无机盐。使用玻璃染色缸。
   2. 依次用40–100 mL 100%乙醇漂洗30秒，40–100 mL Carnoy固定液处理3分钟，40–100 mL 100%乙醇漂洗30秒，40–100 mL 0.1%三氟乙酸（TFA）处理1分钟，再用40–100 mL 100%乙醇漂洗30秒。使用玻璃染色缸。
      注意：Carnoy固定液由六份乙醇、三份乙酸和一份氯仿组成。
   3. 在真空条件下干燥30分钟。
4. 使用甲酸蒸气处理组织切片，以提高尸检脑组织中Aβ蛋白的离子化效率
   1. 准备烘箱和用于后续蒸气处理的玻璃孵育皿，加入5 mL 100%甲酸。为获得理想的酸处理效果，整个过程中应保持孵育玻璃皿内空气湿度处于饱和状态，并将温度维持在60 °C。将组织切片置于孵育玻璃皿中，避免直接浸入甲酸，处理6分钟。
   2. 使用胶片扫描仪、凝胶成像系统或数字显微镜等设备获取样本的光学图像。 等 此步骤应在室温下进行。当样本靶标被放入仪器时，需对齐样本的光学图像。通常情况下，在基质层下方无法识别组织切片。
      注意： 最便捷的获取光学图像的方法是使用办公扫描仪。建议将图像保存至成像数据存储文件夹中。
   3. 为实现光学图像与样本的对应关系，应在光学图像和相机光学系统下基质层可见的位置制作引导标记。最简便的方法是在拍摄光学图像前，在样本周围至少标记三个修正液点。
5. 基质涂布
   1. 基质溶液的配制
      1. 在耐有机溶剂的微量离心管中，配制10 mg/mL的芥子酸（SA）溶液，溶剂为50%乙腈（ACN）和0.1% TFA。通过涡旋振荡或短暂超声处理10分钟，充分溶解SA化合物。溶液配制后于室温保存，备用。
         注意： 基质喷涂有三种不同方式：使用喷枪、超声喷涂仪或自动喷涂仪。
   2. 使用喷枪喷涂基质
      1. 操作应在恒定室温（20–23 °C）和湿度（40%–60%）下进行。为获得最佳喷涂效果，需调节液滴大小、雾化量、喷嘴与组织切片之间的角度和距离，以及实验室温湿度。通过显微镜观察结果来优化上述条件。
         注意：影响因素包括基质结晶的大小与覆盖均匀性，以及分析物的非预期迁移/扩散。液滴越小越好，均匀性也是关键检查指标。
   3. 使用超声喷涂仪喷涂基质
      1. 将待喷涂的组织从干燥器中取出并放入喷涂室。确保组织未覆盖传感器窗口。
      2. 按下 开始 按钮启动准备程序；通常准备时间约为90分钟。系统将根据基质层厚度和湿润度自动调节过程。完成后取出载玻片，在MALDI仪器检测前置于干燥器中干燥15分钟。
      3. 用2–3 mL 100%甲醇（MeOH）清洗喷涂头，直至喷头外观清洁。
         注意：基质微滴形成的细雾依靠重力薄膜沉降进入组织。平均液滴大小为20 μm，所有液滴直径均小于50 μm。
   4. 使用自动喷涂仪喷涂基质
      1. 使用自动喷涂仪将基质溶液喷涂至组织表面。喷涂过程中同时提供恒定流量的加热鞘气（N₂，设定为10 psi和75 °C）。使用溶剂泵系统（设定为10 psi和0.15 mL/min）输送基质溶液。
         注意：最重要的是在生物安全柜内操作，避免吸入基质气溶胶。控制实验室温湿度，以重现均匀的基质结晶。

2. 基质辅助激光解吸电离成像质谱

1. 进行超高速质谱分析。
   1. 使用配备10 kHz掺钕钇铝石榴石（Nd:YAG，355 nm）激光器的基质辅助激光解吸电离成像质谱（MALDI-IMS）系统，开展高通量、高空间分辨率的成像实验。
   2. 在质谱测量过程中，利用MALDI控制软件和数据分析软件定义组织区域。
   3. 以正离子线性模式采集质谱数据，质荷比（m/z）范围为2,000–20,000，空间分辨率为20和100 µm。
   4. 配制校准标准品时，将肽段校准标准品与蛋白质校准标准品按1:4的比例溶解于TA30溶液（乙腈:0.1%三氟乙酸 = 30:70）中的α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）中，随后稀释10倍。将1 μL校准标准品分别点样于载玻片上四个不同位置。
2. 使用分子组织学软件（见 材料表），叠加多个单通道图像，以分析不同信号之间的空间相关性，例如不同Aβ肽在老年斑（SPs）和动脉壁中的共定位情况。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
冷冻切片机	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	CM1950
氧化铟锡（ITO）涂层显微镜载玻片	Bruker Daltonics	#237001
刀片（一次性）	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	#117394
O.C.T. 包埋剂	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	FSC 22 Blue
扫描仪	EPSON	GT-980
喷笔	GSI Creos	PS274
压缩机	MRHOBBY	Mr.Linear compressor L5
超声波喷涂仪	Bruker Daltonics	ImagePrep
自动喷涂仪	HTX Technologies	TM Sprayer
共聚焦激光扫描显微镜	Carl Zeiss Inc.	LSM 700
超高速 MALDI 仪器	Bruker Daltonics	rapifleX MALDI Tissuetyper
MALDI 控制软件	Bruker Daltonics	FlexControl 3.8
分子组织学软件	SCiLS, Bremen, Germany	SciLS Lab 2016a
芥子酸（SA）	Nacalai tesque	30494-91
α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）	Wako	037-19261
校准标准品	Bruker Daltonics