在大鼠模型中检测脑微出血

摘要

来源：Li, D., Zhào, H., 等. 脂多糖注射诱导大鼠亚急性脑微出血。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频展示了一种在大鼠模型中检测脑微出血（CMHs）的实验方法。CMHs 是由于血脑屏障破坏导致的脑内出血，通过外渗的红细胞（RBCs）进行识别。在大鼠模型中，固定后的脑组织经冷冻保护、切片，并用苏木精-伊红染色以标记红细胞，从而可在显微镜下观察 CMHs。外渗的红细胞在显微镜下呈红橙色。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 材料

1. 脂多糖（LPS）注射液的制备
   1. 将25 mg来源于Salmonella typhimurium的LPS粉末溶于25 mL蒸馏水中，配制成终浓度为1 mg/mL的溶液。将注射液置于无菌管中，4 °C保存。
      注意：LPS具有毒性。
   2. 用正常的0.9%生理盐水配制2%伊文思蓝（EB）溶液，使EB注射液保持工作浓度。

2. 动物

通过腹腔注射的方式，向10周龄的雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（平均体重：280 ± 20 g）给予LPS。
注意：若大鼠从其他机构购买，则适应期不应少于7天。

3. LPS 注射

1. 向每只大鼠腹腔注射1 mg/kg的LPS，然后将大鼠放回原笼具中。
   注意： 无需麻醉。
2. 6 小时后，向大鼠注射相同剂量的 LPS。
3. 16小时后，向大鼠注射相同剂量的LPS。
   注意： 向SD大鼠注射1 mg/kg剂量的LPS可能导致5%的死亡率。在幼龄、老龄或妊娠期雌性大鼠中，死亡率可能进一步升高。
4. 在LPS注射后将大鼠放回笼中并提供 随意摄取 饮食获取
   注意： 大鼠将表现出明显的全身性炎症反应，因此在整个实验过程中必须保持笼具清洁。首次注射LPS后，应频繁（每天2次）监测大鼠的体重、一般外观和精神状态。若大鼠开始出现弓背姿势、不愿活动、明显体重减轻（>20%），卟啉染色显示其应在7天EB研究终点前实施人道安乐死。

4. 样本采集

1. EB 注射
   1. 首次注射后第七天，根据您已获批准的 IACUC 方案，对大鼠进行腹腔麻醉。
   2. 等待 1–2 分钟，直至大鼠角膜反射消失。对每只大鼠实施深度为 5–8 mm 的心脏穿刺；穿刺点应位于胸骨左缘第 3 与第 4 肋间间隙处。
   3. 待观察到血液回流后，将 EB 以 0.2 mL/100 g 体重的剂量注入左心室。
      注意： 心脏穿刺与 EB 注射操作需谨慎进行。EB 可能误注入胸腔或心包腔，而非左心室。
      1. 注射前，先用空管回吸，并将该体积替换为 EB 管，有助于降低操作失败率（例如，误将 EB 注入肋骨区域）。
   4. 将大鼠保持仰卧位 10 分钟。
      ​注意： 若样本不用于免疫荧光成像中 EB 渗漏的检测，则可省略此步骤。
2. 肉眼观察
   1. 使用冰冻的 1 M 磷酸盐缓冲液（PBS）进行心脏灌流，以清除脑血管系统及脑组织。
      1. 使用手术刀沿膈肌全长进行腹部切口。
      2. 在肋骨中线左侧稍偏处剪断肋骨。
      3. 打开胸腔，使用止血钳暴露心脏并促进血液及其他液体的排出。
      4. 用镊子稳定夹持心脏（此时心脏仍应跳动），将针头直接插入左心室突出部位，插入深度约 5 mm，并在穿刺点附近夹紧固定针头位置。
         注意： 针头插入不宜过深，以免刺穿心室内壁，影响溶液循环。
      5. 打开阀门，通过灌流泵以约 20 mL/min 的缓慢稳定流速灌注冰冻 PBS 溶液（200–300 mL）。若动物需用于固定而非肉眼观察，则改用相同剂量的冰冻 0.9% 生理盐水溶液。
      6. 使用锐利剪刀在心房处剪开切口，确保灌流液持续流动。若液体流动不畅或从动物鼻孔或口腔流出，应重新调整针头位置。
   2. 通过肉眼观察筛查脑微出血灶（CMHs）。
      注意： 若样本不用于通过肉眼观察计数脑微出血灶数量，则可省略此步骤。
3. 固定
   1. 使用冰冻的 0.9% 生理盐水溶液（200–300 mL）进行心脏灌流，以清除脑血管系统及脑组织。
   2. 使用冰冻的 4% 多聚甲醛进行心脏灌流以固定组织。
   3. 将大鼠断头，取出脑组织，并将其浸入 20% 蔗糖溶液中至少 6 小时。
   4. 更换为 30% 蔗糖溶液，继续固定 6 小时。
4. 使用冷冻切片机制备厚度为 10 mm 的脑组织切片。

5. 苏木精-伊红（HE）染色

注意：本实验步骤使用苏木精-伊红（HE）染色试剂盒进行。

1. 用蒸馏水清洗载玻片。
2. 用苏木精溶液染色 8 分钟。用流动自来水冲洗 5 分钟。
3. 用 1% 酸性乙醇分化 30 秒。用流动自来水冲洗 1 分钟。
4. 用 0.2% 氨水（蓝化）或饱和碳酸锂溶液染色 30 秒至 1 分钟。用流动自来水冲洗 5 分钟。
5. 在 95% 乙醇中漂洗（10 次浸洗）。
6. 用伊红溶液复染 30 秒至 1 分钟。
7. 依次通过 95% 乙醇、两次更换无水乙醇脱水，每次 5 分钟。
8. 用二甲苯透明 30 秒。
9. 采用刘氏法封片。
10. 使用明场荧光显微镜进行观察。
    注意： 从血管中释放的红细胞是 CMHs 的组成部分，在 HE 染色下呈红橙色。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
LPS	Sigma-Aldrich	L-2630	用于诱导炎症
EB	Sigma-Aldrich	E2129	用于EB渗漏检测
HE染色	Solarbio	G1120	HE染色试剂盒
水合氯醛	Sigma-Aldrich	47335U	用于麻醉
磷酸盐缓冲液（PBS）	Solarbio	P1022	实验中常用的缓冲溶液
0.9%生理盐水溶液	海南东联长富药业有限公司，中国		用于灌注的溶液
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	158127	常用于固定的溶液
20%蔗糖溶液	Solarbio	G2461	常用于固定的溶液
30%蔗糖溶液	Solarbio	G2460	常用于固定的溶液
兽用软膏	Solcoseryl眼用凝胶，Bacel，瑞士		用于大鼠眼部保护