制备用于回收突触囊泡光学分析的培养神经元

摘要

来源：Riemann, D. 等，一种用于检测过表达突触前蛋白的培养神经元中突触小泡循环的光学检测方法。J. Vis. Exp. (2018)

本视频演示了为光学分析回收突触小泡而制备培养神经元的实验步骤。该过程包括对突触小泡蛋白进行荧光标记以及通过免疫染色来标记和可视化神经元内的回收小泡。

方案

所有涉及动物样本的实验程序均已通过相应的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 原代海马神经元细胞培养

1. 在胚胎第19天制备大鼠海马组织的离散细胞培养。将细胞以每孔50,000 - 60,000个细胞的密度接种于24孔板中经多聚赖氨酸（PEI）包被的12 mm盖玻片上。使用细胞计数板和相差显微镜检测细胞密度。
2. 将神经元培养3天（第3天） 体外 （DIV）3）在37 °C、5% CO₂的培养箱中，置于24孔板内₂.
3. 使用透射光显微镜评估盖玻片上细胞健康的各项指标（例如， 使用10-20倍放大倍数的相差光学系统观察。检查以下健康状态指标：清晰的相差晕环、神经突无串珠样结构、胞体无聚集现象、神经突无束状结构。

2. 转染

注意：以下方案适用于3个孔的双重转染。然而，制备足够用于4个孔的试剂用量时，实验效果更佳。

1. 在锥形瓶中配制 500 mL 转染缓冲液（274 mM 氯化钠，NaCl；10 mM 氯化钾，KCl；1.4 mM 磷酸氢二钠，Na₂HPO₄

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
B27	Gibco	17504-044
BSA	Sigma	A7030-50g
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3306-100g
dH2O	Invitrogen	15230
DABCO	默克	8.03456.0100
驴抗小鼠 Alexa 647	Jackson ImmunoResearch	715605151	抗体
DMEM	Invitrogen	41966
DPBS	Gibco	14190
Eppendorf管	Eppendorf	30120094
多孔板 24孔	Fisher Scientific	087721H
50 mL 离心管	Greiner Bio-One	227261
FBS 优质	BiochromAG	S0615
葡萄糖	默克	1,08,34,21,000
HBSS	Invitrogen	14170
HEPES	Sigma	H4034-500g
Hera Cell 150（培养箱）	ThermoElectron Corporation
KCl	Sigma-Aldrich	P9541-500g
L-谷氨酰胺	Gibco	25030
MgCl2	霍尼韦尔	M0250-500g
显微镜载玻片	Fisher Scientific	10144633CF
Mowiol4-88	Calbiochem	475904
NaCl	BioFroxx	1394KG001
Na2HPO4	BioFroxx	5155KG001
Neurobasal	Invitrogen	21103049
PBS（10×）	罗氏	11666789001
OptiMEM	Invitrogen	31985
青霉素-链霉素双抗溶液（Penstrep）	Gibco	15140-122
PFA	Sigma	P6148-1kg
安全罩	ThermoElectron		序列号 40649111
蔗糖	neoFroxx	1104kg001
突触结合蛋白1	Synaptic Systems	105311	小鼠单克隆；克隆 604.2
Triton X-100	默克	1,08,60,31,000
Vortex Genius 3	IKA	3340001
水浴锅	GFL	1004