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所有涉及动物样本的实验程序均已通过相应的动物伦理审查委员会审核并批准。
1. 原代海马神经元细胞培养
- 在胚胎第19天制备大鼠海马组织的离散细胞培养。将细胞以每孔50,000 - 60,000个细胞的密度接种于24孔板中经多聚赖氨酸（PEI）包被的12 mm盖玻片上。使用细胞计数板和相差显微镜检测细胞密度。
- 将神经元培养3天（第3天） 体外 （DIV）3）在37 °C、5% CO₂的培养箱中，置于24孔板内2.
- 使用透射光显微镜评估盖玻片上细胞健康的各项指标（例如， 使用10-20倍放大倍数的相差光学系统观察。检查以下健康状态指标：清晰的相差晕环、神经突无串珠样结构、胞体无聚集现象、神经突无束状结构。
2. 转染
注意：以下方案适用于3个孔的双重转染。然而，制备足够用于4个孔的试剂用量时，实验效果更佳。
- 在锥形瓶中配制 500 mL 转染缓冲液（274 mM 氯化钠，NaCl；10 mM 氯化钾，KCl；1.4 mM 磷酸氢二钠，Na2HPO4；15 mM 葡萄糖；42 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸，HEPES）。
- 在锥形瓶中将 8.0 g NaCl、0.37 g KCl、0.095 g Na2HPO4、1.35 g 葡萄糖和 5.0 g HEPES 溶于 400 mL 蒸馏水中。
- 使用 pH 计，以 1 M 氢氧化钠（NaOH）调节 pH 至 6.95。
- 用蒸馏水定容至 500 mL，并使用 pH 计检测 pH。
- 通过移液加入 1 M NaOH，将转染缓冲液分装为 20–30 mL 等份，分别调节至以下 pH 值：6.96、6.97、6.98、6.99、7.00、7.01、7.02、7.03、7.04、7.05、7.06、7.07、7.08、7.09、7.11。
注意：转染缓冲液的 pH 值对转染效率至关重要。
- 为测试哪种 pH 值的转染缓冲液可获得最高数量的转染细胞，需逐一测试 pH 6.96 至 7.11 的缓冲液。采用 2.2–2.11 步所述的转染方法，并使用已验证的表达绿色荧光蛋白（GFP）的质粒。测定每种 pH 值缓冲液条件下每盖玻片的转染细胞数，以评估最佳缓冲液。
- 将转染效率最高的缓冲液分装至 2 mL 微量离心管中，于 -20 °C 冷冻保存。
- 将低血清培养基、细胞培养基和蒸馏水在水浴中预热至 37 °C。
- 在 1.5 mL 微量离心管中配制转染混合液。在超净工作台内操作，以确保无菌条件。
- 将 7.5 µL 2 M 氯化钙与 4 µg 无内毒素 DNA（Synaptophysin-mOrange 和 mGFP/GFP-Rogdi）混合，加水至总体积为 60 µL，置于 1.5 mL 微量离心管中。
- 向混合液中加入 60 µL 转染缓冲液。为获得最佳效果，边轻轻涡旋 DNA 混合液，边逐滴加入转染缓冲液。
- 室温（RT）孵育 20 分钟。孵育期间将离心管置于超净工作台旁，避免振荡。
- 在超净工作台内，使用 1000 µL 移液器从孔中移除细胞培养基（“条件培养基”），并将其储存于培养箱内的单独容器中。
- 向每孔加入 500 µL 低血清培养基。将细胞在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育，直至完成 20 分钟孵育期（步骤 2.3.3）。
- 通过移液向每孔加入 30 µL 转染混合液，分多次滴加。弃去管底残留液。
- 所有孔加样完成后，轻轻摇动 24 孔板，以确保转染混合液在培养基中均匀分布。
- 将各孔在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育 60 分钟。
- 移除并弃去转染混合液，用细胞培养基清洗三次。每孔加入 1 mL 细胞培养基，在室温下孵育 30 秒。移除 750 µL 培养基，加入等量新鲜培养基。重复此步骤三次。
注意：清洗步骤至关重要。应尽量减少各孔无培养基的时间（即，逐孔移除并更换），并轻柔加入清洗培养基。
- 移除并弃去细胞培养基，逐孔加入 450 µL 条件培养基。
- 将神经元置于 37 °C 和 5% CO2 的培养箱中继续成熟，至体外培养第 10 天（DIV 10）。
3. 刺激与Syt1摄取
注意：以下方案适用于3个孔。若需对其他数量的孔进行去极化处理，请相应调整试剂用量。
- 在锥形瓶中配制 50 mL 的 10× 去极化缓冲液（640 mM NaCl，700 mM KCl，10 mM 氯化镁，MgCl2，20 mM 氯化钙，CaCl2，300 mM 葡萄糖，200 mM HEPES，pH 7.4）。
注意：去极化缓冲液可在 4 °C 下保存数周。若需同时使用非去极化溶液，可配制 10× Tyrode 溶液，其成分为 1290 mM NaCl、50 mM KCl、10 mM MgCl2、20 mM CaCl2、300 mM 葡萄糖、200 mM HEPES，pH 7.4，用于比较刺激诱导的囊泡回收与自发性回收。使用前将溶液稀释至 1×，并加入 1 µM 河豚毒素以阻断动作电位的产生。
- 在锥形瓶中，将 1.87 g NaCl、2.61 g KCl、0.1 g MgCl2-6H2O、0.15 g CaCl2-2H2O、3.0 g 葡萄糖-1 H2O 和 2.38 g HEPES 溶于 50 mL 去离子水中。用 NaOH 调节 pH 值，并对溶液进行无菌过滤。使用时将缓冲液用去离子水按 1:10 稀释至 1× 浓度。
- 在 1× 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）中配制 4% 多聚甲醛（PFA）用于刺激后的固定。
- 配制 500 mL 含 4% PFA 的 1× PBS 溶液时，将 20 g 多聚甲醛溶于 450 mL 去离子 H2O 中。
注意：加热可加快溶解速度，但温度不得超过 70 °C，否则 PFA 可能降解。
注意：PFA 具有毒性，可能具有致癌性和致畸性。操作时需佩戴手套，在通风橱中进行，并避免摄入。
- 将溶液冷却至室温，加入 50 mL 10× PBS 储存液。使用 pH 计，以 NaOH/HCl（盐酸）调节 pH 至 7.4。
- 将 600 µL 1× 去极化缓冲液和 10 mL 细胞培养基置于水浴中预热至 37 °C。
- 向 1× 去极化缓冲液中加入 1 µL 小鼠抗 Syt1 抗体（克隆号 604.2），涡旋混匀 10 秒。
- 移除并弃去细胞培养基。向每孔加入 200 µL 去极化缓冲液-抗体混合液，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 5 分钟。
- 移除并弃去去极化缓冲液-抗体混合液，用细胞培养基洗涤 3 次。每次向每孔加入 1 mL 细胞培养基，在室温下孵育 30 秒。吸出 750 µL 培养基，并加入等量新鲜培养基。重复此步骤 3 次。
- 移除并弃去细胞培养基，向每孔加入 300 µL 含 4% PFA 的 1× PBS 溶液。在 4 °C 下孵育 20 分钟。
- 用 1× PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
注意：本方案可在此处暂停。
4. 免疫细胞化学
- 配制 50 mL 封闭缓冲液。
注意：封闭缓冲液可在 -20 °C 保存数月。
- 将 2.5 g 蔗糖和 1 g 牛血清白蛋白（BSA）溶解于 5 mL 10x PBS 储存液中。加入 1.5 mL 10% 去垢剂储存液。搅拌溶液直至所有组分完全溶解，然后加入蒸馏 H2O 至终体积为 50 mL。分装溶液并冻存备用。
- 在每个孔中，用 200 µL 封闭缓冲液按 1:1000 的比例稀释偶联荧光染料的二抗（针对一抗 Syt1 抗体的宿主种属）。
- 移除并弃去含有盖玻片的各孔中的 1x PBS。
- 向每个孔中加入 200 µL 封闭缓冲液-抗体混合液，在室温下孵育 60 分钟。
注意：由于二抗对光敏感，后续所有操作均需在避光条件下进行。
- 孵育结束后，用 1 mL 1x PBS 洗涤细胞三次，每次 5 分钟。
- 将盖玻片用封片介质封固于显微镜载玻片上。
- 在显微镜载玻片上滴加 7 µL 封片介质。用注射器提起并用镊子夹住盖玻片，将其从 24 孔板中取出。
注意：盖玻片表面的细胞容易受损，因此操作镊子时必须小心谨慎。
- 将盖玻片浸入蒸馏水中以去除 PBS，并用软纸轻轻接触其一端将其小心吸干。
- 将盖玻片细胞面朝下翻转至封片介质液滴上，使细胞被包埋于封片介质中。
- 将载玻片置于通风橱中干燥 1–2 小时（需覆盖以避免光照），随后存放于载玻片盒中，4 °C 保存。
注意：本实验方案可在此处暂停。