α-突触核蛋白聚集体处理神经元的免疫染色

摘要

来源：Panattoni, G.，等。向原代神经元外源性施用与微粒体相关的α-突触核蛋白聚集物作为纤维形成的一种高效细胞模型。J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了经α-突触核蛋白（αS）聚集体处理的神经元的免疫染色过程。首先，用αS聚集体处理神经元，随后对其进行固定、通透化，并加入封闭液进行处理。接着依次加入一抗、荧光标记的二抗以及细胞核染料。最后将样品封片，并在显微镜下观察。

方案

1. 神经元处理

注意：处理在体外培养第7天（DIV 7）进行。所有步骤均在细胞培养超净台内无菌条件下操作。图1展示了DIV 7时皮层神经元培养密度的示例。

1. 使用原始匀浆缓冲液（包含 250 mM 蔗糖、20 mM HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸）、10 mM KCl（氯化钾）、1.5 mM MgCl₂（氯化镁）、2 mM EDTA（乙二胺四乙酸）以及 1× 磷酸酶/蛋白酶抑制剂）稀释，将从三只不同患病转基因小鼠脊髓中获得的微粒体相关性 αS 聚集体混合，配制成浓度为 1 µg/µL 的溶液。
2. 取接种于24孔板中多聚-D-赖氨酸盖玻片上的神经元培养物，培养基含 2% B27、10× 庆大霉素和 2 mM 谷氨酰胺。移除三分之一培养基，并轻柔替换为含 2% B27、1× 庆大霉素和 2 mM 谷氨酰胺的新鲜培养基。
3. 向细胞培养基中加入 1 µg 混合后的微粒体相关性α-突触核蛋白（αS）聚集体。将神经元放回 37 °C 培养箱中继续培养。
4. 在接下来的一周内，每隔 3 天添加相当于原体积三分之一的新鲜培养基。不要更换培养基，仅进行添加。
5. 处理 1 周后，移除三分之一培养基，并轻柔替换为含 2% B27、10 µg/mL 庆大霉素和 2 mM....

结果

图1. 大脑皮层神经元培养物。 典型图像显示了体外培养第7天（DIV 7）大脑皮层神经元的细胞密度。图像使用倒置光学显微镜在10倍物镜下拍摄。比例尺 = 100 µm。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
蔗糖	Sigma-Aldrich	84097-1KG
Hepes	Sigma-Aldrich	H0887-100ML	1 M，pH = 7–7.6
EDTA	Sigma-Aldrich	0390-100ml	pH = 8，0.5 M
氯化镁	Sigma-Aldrich	M8266-100G
碳酸钠	Sigma-Aldrich	S7795-500G
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S5761-500G
甲醇	Sigma-Aldrich	322415-6X1L
KCl	Sigma-Aldrich	P9541-500G
cOmplete Mini	Roche	11836170001	蛋白酶抑制剂
PhosStop	Roche	4906837001	磷酸酶抑制剂
BCA 蛋白检测试剂盒	Euroclone	EMPO14500
Criterion TGX 4–20% Stain Free，18 孔	Biorad	5678094
支持型硝酸纤维素膜	Biorad	1620097	0.2 μm
印迹级封闭剂	Biorad	1706404	脱脂奶粉
SuperSignal West Pico 化学发光底物	Termo Fisher Scientific	34077
硝酸	Sigma-Aldrich	1004411000	65%
玻璃盖玻片	Termo Fisher Scientific	1014355118NR1	18 mm ×
聚-D-赖氨酸	Sigma-Aldrich	P7280
Hank's 平衡盐溶液	Termo Fisher Scientific	14170-500 mL
青霉素/链霉素	Termo Fisher Scientific	15140122	10,000 U/mL，100 mL
DMEM 培养基（杜氏改良伊格尔培养基）	Termo Fisher Scientific	D5796-500 mL
胰蛋白酶-EDTA	Termo Fisher Scientific	15400054	0.50%
B27 补充剂	Termo Fisher Scientific	17504044	50×
Glutamax	Termo Fisher Scientific	35050-038	100×
脱氧核糖核酸酶（DNAse）	Sigma-Aldrich	D5025
胎牛血清	Euroclone	EC50182L
谷氨酸	Sigma-Aldrich	1446600-1G
庆大霉素	Termo Fisher Scientific	15710	10 mg/mL
Neurobasal 培养基	Termo Fisher Scientific	10888-022
阿糖胞苷（AraC）	Sigma-Aldrich	C3350000
VECTASHIELD 抗荧光淬灭封片剂	Vector Laboratories	H-1000
DAPI	Termo Fisher Scientific	62247
90 Ti 转子	Beckman	N/A	超速离心机转子
Optima L-90K 超速离心机	Beckman	N/A
Syn-1 抗体，克隆 42	BD Biosciences	610786	抗小鼠，WB：1:5000
Syn303 抗体	BioLegend	824301	抗小鼠，IF：1:1000
Tau 抗体	Synaptic Systems	314 002	抗兔，IF：1:10,000
pser129-αS 抗体	由 Fujiwara 等人惠赠，参考文献 19		抗兔，WB：1:5000
pser129-αS 抗体	Abcam	ab51253	抗兔，IF：1:1000
小鼠 αS (D37A6) XP	Cell Signaling	4179	抗兔，IF：1:200
Alexa Fluor 555 标记抗兔抗体	Termo Fisher Scientific	A27039
Alexa Fluor 488 标记抗小鼠抗体	Termo Fisher Scientific	A-11029
Microson XL-2000	Misonix		超声破碎仪
Ultra 瓶（Oakridge 瓶），PCB，16×76 mm，组件，Noryl 盖，Beckman 型	Science Service EU	S4484	超速离心管
AXIO Observer 倒置光学显微镜	Zeiss	N/A
TCS SP2 激光扫描共聚焦显微镜	Leica	N/A
倒置落射荧光显微镜	Nikon	N/A
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-500ML	非离子型表面活性剂