一种人诱导多能干细胞来源神经元的体外拉伸损伤模型

摘要

来源：Phillips, J. K. 等. 在96孔板中对人诱导多能干细胞来源的神经元进行高速拉伸损伤的方法. J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了在人诱导性多能干细胞来源的神经元（hiPSCNs）上诱导拉伸损伤的过程。将细胞接种于底部无底的多孔板中，该板带有附着的硅胶膜。通过对膜施加可控的机械应力，引起细胞骨架破坏和细胞膜损伤，从而在细胞中诱导出拉伸损伤表型。

方案

1. 培养板制备

1. 用200 W等离子清洗仪对96孔板盖进行等离子处理（参见材料表）在高功率下处理60秒，将芯片底部朝上放入等离子清洗仪中。通过腔室窗口观察是否有紫色辉光出现，该现象表明已形成有效的等离子体。此键合技术改编自Sunkara等人的研究。
2. 60 秒内将培养皿盖倒置（底部朝下）放入 200 mL 去离子水（DI 水）中，其中含有 1.5% 的 (3-氨基丙基)三乙氧基硅烷（APTES），浸泡 20 分钟。该溶液不稳定：应在放入培养皿前不超过 60 秒内配制。
   警告： 在通风橱中操作 APTES。
3. 等离子体处理 在等离子清洗仪中以高功率对提取的硅胶膜进行60秒的等离子体处理。控制等离子体处理时间，使其结束时间不早于1.2步骤中20分钟周期结束前5分钟以上。
4. 使用镊子将经等离子体处理的膜置于 7.5 × 11 cm 的² 羊皮纸矩形。将一块7.5 cm × 11 cm × 0.5 cm的铝板对齐放置于平板制备夹具的下部。用镊子将硅胶膜和羊皮纸在铝板上对齐放置。
5. 从APTES溶液中取出板盖，甩去多余溶液。浸入200 mL去离子水浴中5秒，甩去多余水分。再浸入另一份200 mL去离子水浴中5秒，甩去多余水分。在浸入下一块板盖前，更换上述水浴中的去离子水。
6. 使用压缩空气将板的顶部彻底吹干。
7. 将平板上部置于平板制作夹具的上部位置。轻轻闭合平板制作夹具，使平板上部与硅胶紧密贴合。夹紧至少1小时。
8. 将平板在室温下避尘静置固化24小时后使用。

2. 拉伸培养板

1. 清洁压痕头
   1. 准备一个60 W的浴式超声波清洗器，加入室温去离子水（DI水）。
   2. 将压痕头模块倒置并固定在超声波清洗槽上方，使仅压痕头顶部浸入水中，浸入深度至少1 mm。在42 kHz频率下超声处理8分钟。
   3. 用压缩空气吹干压痕头。
2. 校准压痕头模块
   1. 在拉伸装置上方安装一台具有实时画面输出的相机，使其俯视压痕头阵列。将焦点对准压痕头的顶部。
      注意：第3节“膜拉伸表征”中描述的装置是完成此任务的一种可能相机配置。
   2. 使用载物台夹具将一块培养板固定在损伤装置的载物台上（图1），并在装置上方放置一个环形光源。
      注意：有关仪器控制软件的信息，请参见材料表。
   3. 通过点击控制损伤装置的计算机桌面上的软件图标，启动仪器控制软件。在启动窗口中点击“in_vitro_neurotrauma.lvproj”项目以运行该项目。在项目窗口中，通过双击分别启动名为“motion_control.vi”和“position_tracker.vi”的运动控制和位置追踪虚拟仪器（VIs）。
   4. 关闭包围损伤装置的防护罩。点击运动控制VI左上角的“箭头”按钮以运行VI，然后点击“Near Bottom”将载物台下降至距离接触压痕头约2 mm的位置。点击“Stop”按钮停止VI运行。
      警告：在防护罩内操作相机时，请保持双手远离拉伸装置。防护罩应配备门控开关，仅当防护罩门关闭时才向拉伸装置供电。
   5. 在项目窗口中，右键点击“Axis 1”，选择“Interactive Test Panel”。在打开的窗口中，在“Target Position”字段中输入“500”单位，将步长设为50 µm。
   6. 反复点击“Interactive Test Panel”窗口底部的绿色“go”按钮，直到培养板首次接触任一压痕头。通过相机显示的实时图像检查接触情况。记录“Interactive Test Panel”窗口左上角报告的载物台垂直位置；此即首次接触位置。
   7. 继续进一步降低（如步骤2.2.6所述），直至每个孔均与压痕头接触。如有必要，移动相机以观察整个培养板，并通过设定负的“Target Position”值将载物台上下移动。当所有柱体均接触时，记录窗口左上角报告的载物台垂直位置（此即完全接触位置）。
   8. 记录首次接触与完全接触位置之间的差值。关闭“Interactive Test Panel”。重新运行“motion control VI”（参见步骤2.2.4），点击“Top”将载物台升起，然后使用“Stop”按钮停止运动控制VI。
   9. 当载物台升至行程顶端后，打开防护罩门以切断装置电源。调节压痕头模块四角的定位螺钉。松开最先接触的角上的定位螺钉以降低该角，同时拧紧对角的螺钉以抬高最后接触的角。
   10. 重复降低载物台直至培养板接触压痕头、检查接触图像是否存在倾斜、升起载物台并调节（步骤2.2.9）压痕头模块的过程。当载物台与模块对齐时，所有压痕头将同时接触。
   11. 打开防护罩门以切断装置电源。将固定螺钉插入压痕头模块的螺孔并拧紧。确认在固定螺钉安装到位后模块保持水平（参见步骤2.2.4–2.2.8）。记录培养板接触时“Interactive Test Panel”报告的载物台位置。该位置将作为压痕实验的零位。
3. 润滑压痕头
   1. 若压痕头模块刚安装完成且尚未润滑，先用浸有乙醇的实验室擦拭纸清洁一块实心橡胶垫（7.5 cm × 11 cm × 1.5 mm）和一块柔软的闭孔泡沫橡胶垫（7.5 cm × 11 cm × 3 mm），然后让其自然晾干。
   2. 将实验室擦拭纸浸入玉米油，并在实心橡胶垫上涂抹至呈现暗光泽。
   3. 将泡沫垫置于实心橡胶垫上，以转移油脂。在其上方放置一块7.5 cm × 11 cm × 0.5 cm的铝板，并加载约360 g的配重（例如，6个锥形管，每管装45 mL水），以确保油脂从实心橡胶垫均匀转移到泡沫垫上。静置10秒，使油脂充分转移至泡沫橡胶垫。
   4. 将泡沫橡胶垫移至压痕头阵列上方。在其上放置铝板和配重，以确保油脂均匀转移至压痕头顶端。静置10秒，使油脂充分转移至压痕头。
   5. 若自压痕头模块首次安装并润滑后尚未进行过拉伸操作，则在开始实验前先拉伸一块测试板。注意：此举可避免首次拉伸与后续拉伸之间的不一致性干扰实验结果。对于后续拉伸，每次拉伸前仅需重复步骤2.3.2–2.3.5。
4. 拉伸一块培养板
   1. 按照步骤2.3所述方法润滑压痕头。
   2. 使用载物台夹具将培养板固定在损伤装置的载物台上。若需保持无菌，可调整盖子位置，以固定培养板的同时避免培养表面暴露于空气中。
   3. 使用“motion control VI”（参见步骤2.2.4–2.2.6）将载物台降至零位；零位在步骤2.2中确定。
   4. 在“position tracking VI”的“file path”字段中更改文件名为唯一名称，然后点击该窗口左上角的“箭头”按钮运行VI。
   5. 在“movement control panel VI”的“Injury (mm)”和“Injury Duration (ms)”字段中，通过点击字段并输入所需数值，设定压痕深度和持续时间（通常分别为1–4 mm和30 ms，最大深度5 mm，最短持续时间15 ms）。
   6. 运行“movement control panel VI”，点击“Injure”以对培养板进行压痕。
   7. 点击“Top”将载物台升至行程顶端，然后点击“Stop”按钮停止VI运行，并通过打开防护罩门关闭损伤装置。
   8. 检查“position tracker VI”中显示的载物台位移历史，确认已施加指定的最大位移。右键点击图表，选择“export to Excel”，然后点击“File | Save”保存数据。

3. 膜拉伸的表征

1. 将每个压头顶部的凹槽涂成白色，以在高速摄像时提供高对比度的背景。注意：切勿将压头与培养板接触的边缘部分涂漆。
2. 使用聚乳酸（PLA）或其他材料3D打印一个圆柱形印章，用于在每孔中制作标记点。将圆柱体制作成直径5.9 mm、高12.2 mm，并在顶部中心设置一个直径1.5 mm、高1.0 mm的圆柱形凸起。
3. 将培养板正面朝上进行等离子处理60秒，以激活孔内硅胶细胞培养表面，具体操作如步骤2.1所述。
4. 将培养板放置在橡胶垫或其他柔软表面上。用永久性记号笔的墨水预处理印章上的小凸起（见步骤1.2）。将印章插入待测孔中并轻敲，确保墨水良好转移。每次使用前均需重新预处理印章。
5. 对压头模块进行对齐，并润滑损伤装置的压头（见步骤2.2–2.3）。将培养板夹紧固定在损伤装置的载物台上。在损伤装置上方放置一个明亮的漫射轴向光源。
6. 在损伤装置上方的悬臂支架上安装高速相机，镜头垂直向下，将光圈调至最小编号的f值，并打开相机电源。启动连接相机的计算机上的相机软件。在帧率下拉菜单中选择每秒2,000帧，在快门下拉菜单中选择能够获得高对比度图像的最短曝光时间。将相机视野中心对准带有标记点的孔位。​
   1. 调整相机位置，使视场包含呈3×4排列的12个孔。
      注意：对于1,280 × 1,024分辨率的图像，此视场在通量和分辨率之间提供了最佳折中。
7. 将培养板下降至零点位置（见步骤2.2.4–2.2.6）。单击相机软件中的录制按钮，使其显示“触发中”。启动位置追踪VI程序（步骤2.4.4）。
8. 打开明亮的漫射轴向光源。按照步骤2.4.6所述对培养板施加压痕。
9. 关闭明亮的漫射轴向光源。
10. 在相机控制计算机上，找到记录中发生压痕的30–40毫秒时间段：在相机软件的高速视频播放条中拖动起始和结束箭头。点击“保存”，在“文件名”字段中设置名称，在“格式”字段中选择“TIFF”，然后点击“保存”。
    1. 浏览生成的.TIF文件，找出拉伸程度最小（起始状态）和最大（峰值压痕状态）的图像。
    2. 使用Fiji软件将拉伸最小和最大的图像并排打开，测量两个状态下标记点的高度和宽度。使用默认的矩形选择工具，在拉伸最小的图像中标记点周围点击并拖动以绘制一个矩形框。通过“分析|测量”功能测量其高度和宽度。
    3. 对同一孔在峰值拉伸图像中的标记点重复上述操作。对所有其他孔重复此过程。
11. 按下式计算x和y方向的拉格朗日应变：
    
    注意：其中，E_xx 表示 x 方向的拉格朗日应变，E_yy 表示 y 方向的拉格朗日应变，X 为标记点的宽度，Y 为标记点的高度，_f 表示最终图像（即峰值压痕图像），_i 表示初始图像（即压痕前图像）。取两个方向应变的平均值作为该孔的应变值。

4. 培养细胞的接种

1. 将用于灭菌的容器和配重块进行高压灭菌。
2. 将硅胶底板正面朝上进行等离子处理60秒（见步骤1.1）。立即将其浸入含有70%乙醇的无菌容器中，静置15分钟。
3. 将平板分别浸入盛有无菌磷酸盐缓冲液（PBS）的无菌容器中，静置30分钟。
4. 吸除孔中的PBS。每次仅干燥一块板，以防止孔失去等离子处理效果。
   注意：与刚性板相比，硅胶底板在移液时触感反馈较弱，更容易堵塞移液枪头。
5. 向已灭菌的板中每孔加入100 µL浓度为0.1 mg/mL的多聚-L-鸟氨酸（PLO），于室温孵育1小时。
6. 用100 µL无菌PBS清洗孔两次，第二次清洗后将PBS保留在孔中，直至细胞悬液准备就绪。
7. 佩戴安全手套从液氮中取出hiPSCN冻存管，置于干冰上。迅速将冻存管转移至37 °C水浴中，准确解冻3分钟。切勿摇动冻存管。
8. 在无菌操作台内，使用1 mL移液管将冻存管内容物轻柔转移至50 mL锥形管中。
9. 用1 mL室温完全维持培养基（基础培养基 + 添加剂）冲洗空的冻存管。
10. 以大约每秒一滴的速度将1 mL培养基逐滴加入50 mL管中。在加入过程中轻柔旋转管子。随后以约每秒两滴的速度向50 mL管中加入8 mL室温完全维持培养基。
11. 盖紧管盖并轻轻倒置混匀2–3次。使用血细胞计数板对细胞进行计数，并计算所需额外培养基的体积，以将细胞悬液稀释至225,000个细胞/mL。
12. 使用25 mL移液管，将上述计算出的培养基体积轻柔加入细胞悬液管中。
13. 使用1,000 µL微量移液器，按每1 mL细胞悬液加入10 µL浓度为1 mg/mL的层粘连蛋白原液，使细胞悬液中层粘连蛋白终浓度为10 µg/mL。用加入层粘连蛋白的枪头轻轻吹打一次，然后盖紧管盖并倒置混匀一次。
14. 逐块吸除板中PBS。使用多通道移液器向每孔加入100 µL hiPSCN细胞悬液。每孔培养面积为0.33 cm²，因此细胞密度为67,500个细胞/cm²。
15. 接种后将板在室温下静置15分钟，以促进细胞贴壁。为避免无菌培养操作台风扇振动，将盖好盖的板放置于实验台面上。将培养物置于37 °C、5% CO₂条件下孵育。
16. 在24小时后进行全量换液，每孔补充200 µL完全维持培养基。此后每2–3天进行半量换液，每孔更换100 µL。

5. 损伤培养物

1. 按照步骤 2.2 所述，对齐压痕块并找到零位。按照步骤 2.3 所述，对压头进行润滑。
2. 在“位移追踪 VI”中设置位移历史记录的文件名（步骤 2.4.4）。在“运动控制 VI”中设置损伤参数（步骤 2.4.5）。
3. 将待损伤的培养板从培养箱中取出，并将其固定在载物台上。调整盖子的位置，以固定培养板，同时避免培养物暴露于室温空气中。
4. 使用“运动控制 VI”将培养板降至零点位置（步骤 2.2.4–2.2.6）。启动“位移追踪 VI”（步骤 2.4.4）。
5. 使用运动控制 VI 对培养板进行压痕操作（如步骤 2.4.6 所述）。对于假损伤（sham）处理，仅跳过此步骤。
6. 将载物台返回至其运动范围的顶部位置（见步骤 2.4.7）。将培养板放回培养箱中。
7. 检查并保存位移轨迹（如步骤 2.4.8 所述）。

结果

图1：损伤装置的标注示意图。（A）顶视图，（B）等距视图，（C）前视图，（D）右侧视图。比例尺适用于正交视图（A、B 和 D）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
.010" 硅胶片	Specialty Manufacturing, Inc	#70P001200010	聚二甲基硅氧烷 (PDMS) 片
Sparkleen	Fisher Scientific	#043204
Nunc 256665	Fisher Scientific	#12-565-600	无底96孔板
Kim Wipes	ULINE	S-8115
等离子清洗机	Harrick Plasma	#PDC-001-HC
(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷	Sigma-Aldrich	#440140	APTES
烘焙纸	Reynolds	N/A
圆顶灯	CCS inc	LFX2-100SW
圆顶灯电源	CCS inc	PSB-1024VB
轴向漫射照明单元	Siemens	Nerlite DOAL-75-LED	漫射轴向光源
高功率LED阵列	CREE	XLamp CXA2540	高功率LED阵列
LED支架	Molex	1807200001	LED支架
LED电源	Mean Well	HLG-320H-36B	恒流电源
FastCam Viewer软件	Photron		相机软件
Fastcam Mini UX50	Photron	N/A	高速相机
Micro-NIKKOR 105mm f/2.8	Nikon	#1455	高速相机镜头
0.1 mg/mL 聚-L-鸟氨酸	Sigma-Aldrich	#P4597
iCells	Cellular Dynamics International	#NRC-100-010-001
iCell 培养基	Cellular Dynamics International	#NRM-100-121-001
iCell 添加剂	Cellular Dynamics International	#NRM-100-031-001
层粘连蛋白	Sigma-Aldrich	#L2020
音圈驱动器	BEI Kimco	LA43-67-000A
光学线性编码器	Renishaw	T1031-30A
伺服驱动器	Copley Controls	Xenus XTL
控制器	National Instruments	cRIO 9024 实时PowerPC控制器
cRIO 机箱	National Instruments	cRIO 9113
数字输入模块	National Instruments	NI 9411
数据采集机箱	National Instruments	NI 9113
LabVIEW	National Instruments
hiPSCNs	Cellular Dynamics International