利用局灶性激光损伤建立斑马鱼视网膜变性与再生模型

摘要

来源：Conedera, F. M.，等。斑马鱼激光诱导视网膜变性与再生模型中 Müller 胶质细胞的激活。J. Vis. Exp. (2017)。

本视频演示了使用激光损伤在成年斑马鱼中诱导视网膜变性的操作步骤。激光靶向视网膜中的感光细胞，引发细胞死亡及退行性过程。该损伤可激活穆勒胶质细胞（MG），促使其去分化为干细胞前体细胞，从而促进视网膜再生。

方案

所有涉及动物模型的实验步骤均已通过当地机构动物护理委员会以及 JoVE 兽医评审委员会的审核。

1. 动物

1. 在水温为 26.5 °C、光照周期为 14/10 小时（光/暗）的标准条件下，饲养年龄在 6 至 9 个月之间的 TgBAC (gfap:gfap-GFP) 斑马鱼 167 (AB) 品系。

2. 可逆性全身麻醉

1. 通过将400 mg三卡因粉末溶解于97.9 mL养殖水和2.1 mL 1 M Tris缓冲盐水（TBS）中，配制三卡因（ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt）储备液。用1 M Tris（pH 9）调节pH至7.0，并在避光条件下4 °C保存，最多可使用一个月。
   注意：三卡因应使用与动物自然生存环境相同的水配制，最好使用原始养殖水。
2. 将储备液按1:25比例用养殖水稀释，并立即使用。
3. 将斑马鱼放入含有50 mL麻醉液的10 cm培养皿中，直至其失去活动能力且对外界刺激无反应（约2–5分钟，具体时间取决于体重和年龄）。
4. 用手将每条鱼转移至定制的硅胶固定夹具中，用于激光处理（图1A）。
   警告！ 鱼在离开水箱后仅可维持麻醉状态不超过10分钟。
5. 处理和/或成像结束后，为逆转麻醉状态，将斑马鱼放入盛有养殖水的容器中。
6. 为促进恢复，通过在水中来回移动斑马鱼，使其鳃部持续流过新鲜养殖水。

3. 视网膜激光聚焦损伤

注意： 使用532 nm半导体激光器在斑马鱼视网膜上制造局灶性光损伤。该激光器的实验装置可实现在成年斑马鱼中建立可重复的局灶性视网膜损伤。

1. 设置激光输出功率：70 mW；光束直径：50 µm；脉冲持续时间：100 ms。
   注意！ 激光光束的使用需要采取适当的个人防护措施，并对使用区域进行明确标识。
2. 治疗前在左眼局部滴加1–2滴2%羟丙基甲基纤维素，并使用2.0 mm眼底激光镜将激光瞄准光束聚焦于视网膜上。
   注意！ 羟丙基甲基纤维素滴眼液具有黏性，若进入鳃部可能引起呼吸困难。
3. 在左眼视神经周围放置四个激光光斑，并以未处理的右眼作为内部对照。

结果

图1：斑马鱼视网膜激光损伤诱导及后续OCT分析的实验装置。 (A) 治疗前激光系统的配置。(A.1) 斑马鱼置于硅胶固定针架上，眼底接触镜已就位，即将施加激光束。(B) 成像前OCT系统的配置。(B.1) 斑马鱼置于78D裂隙灯镜头前，通过OCT检测损伤部位。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
羟丙基甲基纤维素 2%	OmniVision, Neuhausen, Switzerland	n.a.	Methocel 2%
氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	A5040	Tricaine, MS-222
Visulas 532s	Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Germany	n.a.	532 nm 激光器
硅胶固定针夹具	Huco Vision AG Switzerland	n.a.	根据灭菌托盘中的硅胶针垫手工裁剪制成。
TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) 品系	KIT, Karlsruhe, Germany	15204	http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3
Tris 缓冲盐水 (TBS)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P5912
眼底激光镜片	Ocular Instruments, Bellevue, WA, USA	OFA2-0