使用实时环磷酸腺苷检测法测量气味受体激活

摘要

来源：Zhang, Y. et al., 利用实时 cAMP 检测法进行活细胞气味受体激活的测量。J. Vis. Exp.(2017)

本视频演示了利用环磷酸腺苷（cAMP）生物传感器和发光检测技术，在转染细胞中检测气味受体激活的实验方案。该方法可用于研究嗅觉神经元中的受体-配体相互作用及信号转导通路。

方案

1. 利用实时cAMP检测法刺激并测量气味受体（OR）活性

1. 在相差显微镜下观察转染后的细胞，确保每孔细胞融合度为50-80%，然后放回培养箱中继续培养。
2. 通过向Hank's平衡盐溶液（HBSS）中添加10 mM羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）和5 mM葡萄糖，制备刺激培养基。
3. 将实时cAMP检测底物试剂分装样品置于冰上解冻。将底物试剂以每管55 µL分装于聚合酶链式反应（PCR）管中，于-80 °C保存。每块板使用一管。
4. 通过将55 µL底物试剂与2750 µL HBSS/HEPES/葡萄糖溶液混合，配制2%平衡溶液。
5. 在实验台上铺一层厚的纸巾。将培养板倒置，轻轻反复敲击纸巾，使转染培养基被完全吸收。
6. 用移液器向每孔加入50 µL HBSS/HEPES/葡萄糖溶液，洗涤细胞。
7. 轻轻反复敲击96孔板，去除HBSS/HEPES/葡萄糖溶液。
8. 向每孔加入25 µL 2%平衡溶液，在室温避光条件下孵育2小时。
9. 提前用二甲基亚砜（DMSO）配制1 M气味分子储备液，并于-20 °C保存备用。
10. 在孵育结束前，将气味分子储备液用HBSS/HEPES/葡萄糖刺激培养基稀释至工作浓度。
    注意：本步骤中配制的气味分子稀释液浓度应为所需最终浓度的两倍，以确保每孔中达到正确的终浓度。
11. 使用化学发光酶标仪，在加入气味分子之前，以每孔1000 ms的速率连续测量培养板的基础发光水平两次。
12. 迅速将培养板从酶标仪中取出，向每孔加入25 µL气味分子稀释液，并立即开始对所有孔进行连续发光检测，30分钟内完成20个循环的测量。
    注意：当在同一块板中使用不同气味分子或同一气味分子的不同浓度时，应小心移液，避免污染相邻孔。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMSO	Sigma	D2650
GloSensor cAMP 试剂	Promega	E1290
HBSS（不含氯化钙和氯化镁）	GIBCO	14175095
HEPES	Hyclone	SH30237
麝香酮	Santa Cruz	sc-200528
西藏麝香	Sigma-Aldrich	S359165
PBS（不含钙或镁）	Cellgro	21-040-CV
0.2 mL PCR 管	Axygen	PCR-02-C
1.5 mL Eppendorf 管	Eppendorf
15 mL 17 mm × 120 mm 锥形离心管	BD Falcon	352096
8通道和/或12通道移液器	Eppendorf
96孔平底白色细胞培养板	Greiner	655098
100 mm × 20 mm 细胞培养皿	BD Falcon	353003
Infinite F200 酶标仪	Tecan