使用实时环磷酸腺苷测定法测量气味受体激活

摘要

来源:Zhang， Y. et al.， 使用实时 cAMP 测定法测定气味受体激活的活细胞测量。 （2017 年）

该视频演示了使用环磷酸腺苷 （cAMP） 生物传感器和发光检测来测量转染细胞中气味受体激活的方案。该方法应用于研究嗅觉神经元中的受体-配体相互作用和信号通路。

方案

1. 使用实时 cAMP 检测刺激和测量气味受体 （OR） 活性

1. 在相差显微镜下观察转染的细胞，以确保每孔 50-80% 的适当汇合，然后返回培养箱。
2. 通过将 10 mM 羟乙基哌嗪乙磺酸 （HEPES） 和 5 mM 葡萄糖添加到 Hank 平衡盐溶液 （HBSS） 中来制备刺激培养基。
3. 在冰上解冻实时 cAMP 测定底物试剂等分试样。将底物试剂在 -80 °C 下以每管 55 μL 的浓度储存在聚合酶链反应 （PCR） 管中。每板使用 1 管。
4. 通过将 55 μL 底物试剂和 2750 μL HBSS/HEPES/葡萄糖溶液混合，制备 2% 平衡溶液。
5. 在长凳上铺上一层厚厚的纸巾。在纸巾上轻轻地重复敲击板，使转染培养基完全被纸巾吸收。
6. 通过向每个孔中移液 50 μL HBSS/HEPES/葡萄糖溶液来洗涤细胞。
7. 轻轻地反复从 96 孔板中敲出 HBSS/HEPES/葡萄糖溶液。
8. 向每个孔中移取 25 μL 2% 平衡溶液，并在室温下避光孵育 2 小时。
9. 提前在二甲基亚砜 （DMSO） 中制备 1 M 加臭剂储备溶液，并在 -20 °C 下储存直至使用。
10. 在孵育时间结束之前，在 HBSS/HEPES/葡萄糖刺激培养基中将加臭剂储备溶液稀释至工作浓度。
    注意:在该步骤中制备的加臭剂稀释液的浓度应加倍，以便在每个孔中产生正确的最终浓度。
11. 使用化学发光读板器，在添加气味剂之前，以每孔 1000 ms 的速率连续 2 次测量板的基础发光水平。
12. 从读板器中快速取出板，向每个孔中加入 25 μL 加臭剂稀释液，并立即开始在 30 分钟内对所有孔进行 20 次循环的连续发光测量。
    注意:在同一板中使用不同的加臭剂和/或不同浓度的相同加臭剂时，请小心移液，以避免污染相邻的孔。

材料