利用离子选择性微电极与离子电渗微电极表征脑切片中的细胞外空间

摘要

来源：  Odackal, J.，等。利用四甲基铵实时离子电渗法量化脑细胞外间隙的容积分数与迂曲度。J. Vis. Exp. (2017)

本视频演示了如何利用离子选择性微电极和电泳微电极测量并比较电信号，以表征脑切片中的细胞外间隙。该过程有助于确定细胞外间隙的体积分数及其迂曲程度。

方案

所有涉及动物样本的实验程序均已通过相应的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 脑片中的实时离子电渗法

1. 将一片400 µm厚的脑片置于记录室中，确保其完全浸没在流动的人工脑脊液（ACSF）中。使用水彩画笔调整脑片位置，并用网格固定器轻轻固定。
2. 将离子电泳微电极和离子选择性微电极移至脑片感兴趣区域的上方。将两者浸入流过的ACSF中，但保持在脑片上方。
3. 将参考通道和离子感应通道的电压均调零至“0” mV。等待两个通道的电压稳定。在图表记录仪上标记离子选择性微电极（ISM）的离子感应通道所测得的电压。利用该值在Wanda软件中计算基线V参数。
4. 将离子选择性微电极（ISM）和离子电渗微电极插入脑片中，深度为200 µm，两电极间距为120 µm。微电极插入脑片后，等待信号稳定。
   注意： 施加到离子电渗微电极上的偏置电流会导致四甲基铵（TMA）轻微积聚。过早进行记录而低估信号累积是一种常见错误。
5. 在图表记录仪上，标记脑片在离子传感器通道上测得的稳定电压。计算第8.3步和第8.4步测得的TMA信号之间的电压差，并将该值输入Wanda图形用户界面（GUI）中“测量电极”框的“基线电压（mV）”字段。
6. 在图形用户界面（GUI）的左侧，确保所有实验参数均已正确记录/输入。将“Medium”（介质）设置为“Brain”（脑组织），“Transport number”（迁移数）设置为步骤7.4中计算得到的离子电泳微电极的平均值，将“Temperature”（温度）设置为含有脑片的灌流槽的温度。
   注意: V 每次测量必须记录基线数据。 V 将由 Wanda 转换为基线 C （mM）参数即， 脑组织中TMA的浓度）
7. 点击“Acquire”开始记录，并完成一次完整的记录。待TMA信号恢复至基线水平后，再进行下一次记录。
8. 在将微电极从选定的脑区位置移除之前，连续采集两到三次记录。每次记录前，立即将测得的温度输入Wanda软件。
9. 将两根微电极对角向后移动至切片表面，提升至切片上方至少50 µm处。使用图表记录仪，确定当前测得的V值与步骤8.3中测得值之间的任何变化。
10. 将离子选择性微电极（ISM）与电泳微电极的尖端在x、y和z轴方向上相互对准。如有间距变化，可从显微操作器控制箱的显示屏上获取。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ISM 放大器	Dagan	型号 IX2-700 双通道细胞内前置放大器	离子和参考电压放大器，配备 N=0.1（参考毛细管）和 N=0.001（离子毛细管）的探头
生物用复合显微镜（带 4x 和 10x 物镜）			用于修整微电极尖端并检查微电极；多个供应商可选，例如 AmScope
硼硅酸盐 θ 型毛细玻璃管	Harvard Apparatus	Warner Instruments 型号 TG200-4；货号 #64-0811	用于制备离子选择性微电极和电泳微电极的双通道玻璃管；外径 2.0 mm，内径 1.4 mm，隔膜厚度 0.2 mm，长度 10 cm
图表记录仪			用于在四甲基铵标准液校准期间及 RTI 实验过程中连续记录离子选择性微电极的电压；例如 Kipp & Zonen 型号 BD112 双通道图表记录仪，可购买翻新设备
商用软件	The MathWorks	MATLAB，数据采集工具箱	用于使用 Wanda 和 Walter 程序进行数据采集与分析。请注意，可申请学术许可。
护目镜	Fisher
固定式载物台复合显微镜	Olympus	BX51WI	也可使用其他带有固定载物台的复合显微镜
镊子	Fine Science Tools	#11251-10	用于修整玻璃毛细管；推荐使用 Dumond #5 镊子，最好是已使用过且不再用于精细操作的
电泳装置	Dagan	ION-100 和 PS-100	ION-100 为单通道电泳装置，±130 V 输出能力；PS-100 为外接电源；替代产品：例如 Axon Instruments（现为 Molecular Devices）生产的 Axoprobe-1A，已停产，可在 eBay 等网站查找翻新设备
微电极夹持器	WPI	M3301EH	用于夹持离子选择性微电极预制件，以便进行硅烷化处理，并向离子选择性通道尖端填充液态离子交换剂；WPI 销售两种版本的该夹持器，透明型 M3301EH 和黑色型 M3301EH。根据我们的经验，透明型 M3301EH 比黑色型更坚固耐用。
显微操作器	Narishige	MM-3	用于在硅烷化处理及向离子选择性通道尖端填充液态离子交换剂时定位离子选择性微电极预制件；可用任何工作状态良好的三轴显微操作器替代
5x 干式物镜	Olympus	MPlan N
10x 水浸物镜	Olympus	UMPlan FL N	10x 物镜为水浸式，数值孔径 0.3，工作距离 3.3 mm
固定式显微镜用平台及 x-y 平移载物台	EXFO	Gibraltar Burleigh	平台用于承载切片室、显微操作器及附件，x-y 平移载物台可在不破坏记录稳定性的前提下移动显微镜
具备精确 x、y、z 定位功能的机器人显微操作器	Sutter Instruments	MP-285	需要两个显微操作器分别独立夹持离子选择性微电极和电泳微电极。也可将微移液管粘合成间隔排列阵列（见正文）。
带低通滤波器的信号调理单元	Axon Instruments	CyberAmp 320 或 380	制造商已不再供货，但可能在 eBay 上可购得；替代产品：例如 Cygnus Technology 的 FLA-01 滤波/放大器。该设备为单通道仪器，使用多极贝塞尔滤波器时最低截止频率为 10 Hz，但公司可根据需要修改为更低截止频率（2 Hz）。
银丝	A-M Systems	#7830	直径 0.015"，裸丝（无涂层）
切片室	Harvard Apparatus	Warner 型号 RC-27L	此为浸没式切片室；请勿使用界面式切片室
体视显微镜			用于硅烷化处理及向离子选择性通道尖端填充液态离子交换剂；水平安装；多个供应商可选
四甲基铵（TMA）氯化物	Sigma-Aldrich	T-3411	5 M 溶液；注意：具有急性毒性（经口、经皮、吸入），可能致癌，对水生环境有害，详见 Sigma-Aldrich 安全信息说明