通过淀粉样蛋白-β肽注射建立阿尔茨海默病大鼠模型

摘要

来源：Xiaoguang, W.，等。通过脑室内注射复合β-淀粉样蛋白建立大鼠阿尔茨海默病有价值的模拟模型。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频演示了注射淀粉样蛋白β肽、氯化铝和一种神经炎症性生长因子的操作步骤，这些物质共同促进海马区毒性淀粉样斑块的形成。这会导致大鼠出现记忆障碍，具有阿尔茨海默病的典型特征。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 手术步骤

注意：将20只雄性Sprague-Dawley大鼠通过微量注射将复合的淀粉样蛋白β（Aβ）注入侧脑室和丘脑前背核，并指定为复合Aβ处理组。另取20只大鼠接受相同的手术操作，但微量注射0.1%二甲基亚砜（DMSO）生理盐水，并指定为假手术组。

1. 通过吸入100%异氟烷麻醉大鼠，随后将其固定于脑立体定位仪上。
2. 使用手术剪剃除头顶部的毛发，并用碘伏消毒，然后在头部覆盖一次性手术巾。
3. 沿颅骨正中矢状线使用手术刀片和剪刀切开头皮。
4. 分离皮下组织和筋膜，用无菌干棉球擦拭颅骨表面以止血，并用记号笔标记前囟点（bregma）。
5. 以前囟点为原点参照大鼠脑立体定位图谱，标记三个位点：用于注射重组人转化生长因子-β1（RHTGF-β1）并固定一颗螺丝的丘脑前背核（ad）（后向（P）：前囟后2.0 mm；侧向（L）：中线外1.4 mm）；用于注射β-淀粉样蛋白25-35（Aβ25-35）和三氯化铝（AlCl₃）的侧脑室（LV）区域（后向（P）：前囟后0.8 mm；侧向（L）：中线外2.0 mm）；以及用于固定第二颗螺丝的位置（前向（F）：前囟前2.0 mm；侧向（L）：中线外1.5 mm）。
6. 使用可调速骨钻在颅骨上述三个位点（见步骤1.5）处轻轻钻出直径1 mm的孔。钻孔深度以刚好穿透颅骨为宜，避免过深刺伤脑组织。
7. 反复使用无菌干棉球止血并清洁颅骨表面。
8. 将连接微量注射泵的针头插入脑内深度4.6 mm处，缓慢注入1 μL RHTGF-β1（10 ng）至ad区。注射完成后留针2分钟，然后缓慢拔出针头。
9. 使用小螺丝刀将两颗螺丝分别固定于ad区及颅骨第二螺丝固定位点（见步骤1.5），固定时避免过深旋入，以防刺伤脑组织。
10. 组装套管植入系统，高压消毒后将假芯插入导向套管内。
11. 借助大鼠立体定位仪的套管固定器，将不锈钢导向套管经颅骨孔插入脑内深度4.6 mm处的LV区域。
12. 按每1 mL义齿基托水加入1.5 g义齿基托粉的比例混合，将调和后的糊状物覆盖于导向套管的塑料基座及两颗固定螺丝上，以固定导向套管，并完全覆盖皮肤切口，防止皮肤感染。
13. 术后第2天，使用小动物麻醉机通过吸入异氟烷对大鼠进行麻醉，取出假芯，将内套管插入导向套管中，并旋紧固定螺丝以固定内套管。
14. 连接连接微量注射泵的聚乙烯管至内套管，调节注射速度为1 μL/min，向侧脑室（LV）微量注射Aβ25-35或AlCl₃。
15. 在异氟烷麻醉下，每日上午向LV区注射Aβ25-35 4 μg（1 μL），连续注射14天；每日下午注射AlCl₃（1%）3 μL，连续注射5天。
16. 注射完成后等待5分钟，轻柔拔出内套管，再次将假芯插入导向套管中。
17. 术后第15天（即Aβ25-35最后一次注射日），拆除套管植入系统。使用手术剪和镊子小心去除固化的义齿基托材料，旋下两颗固定螺丝，拔出导向套管，用聚维酮碘对伤口进行消毒，用骨水泥填充颅骨孔洞，并采用单纯间断缝合法缝合皮肤。
18. 对假手术组大鼠进行相同操作，但微量注射0.1% DMSO生理盐水。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Sprague-Dawley 大鼠	北京维通利华实验动物技术有限公司，中国	SCXK(京) 2012-0001	300–350 g
可移动式小动物麻醉机	瑞沃德生命科学有限公司，中国	R580
脑立体定位仪	瑞沃德生命科学有限公司，中国	68001
柔性骨钻	上海软隆科技发展有限公司，中国	BW-sD908
透射电子显微镜	日本株式会社，日本	JEM-1400
双通道微量注射泵	瑞沃德生命科学有限公司，中国	RWD202
电镜切片机	日立有限公司，中国	H-7650
假埋置导管	瑞沃德生命科学有限公司，中国	62001	外径0.64×内径0.45 mm/M3.5 http://www.rwdls.com/English/Product/3985102014.html
引导导管	瑞沃德生命科学有限公司，中国	62101	外径0.40 mm/M3.5
内导管	瑞沃德生命科学有限公司，中国	62201	外径0.41×内径0.25 mm/M3.5
紧固螺母	瑞沃德生命科学有限公司，中国	62501	外径5.5 mm/长7.5 mm/M3.5
固定螺钉	瑞沃德生命科学有限公司，中国	62514	M1.2×L2.0 mm(100BAO)
螺丝刀	瑞沃德生命科学有限公司，中国	62999	45*1 mm
PE 管	瑞沃德生命科学有限公司，中国	62302
β-淀粉样蛋白 25-35	Sigma Aldrich 公司，美国	SCP0002-5MG
重组人转化生长因子-β1	PeproTech 公司，美国	100-21
三氯化铝	天津市科密欧化学试剂有限公司，中国	3011080
磷酸锌牙科水泥	上海医疗器械厂牙科材料，中国	201311