通过转移水通道蛋白-4特异性Th17细胞在小鼠模型中诱导瘫痪

摘要

来源：Sagan, S. A. 等，特异性识别视神经脊髓炎自身抗原水通道蛋白-4的T细胞在小鼠中诱导瘫痪和视觉系统损伤。J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了通过将靶向水通道蛋白-4的活化Th17细胞转移至小鼠模型来诱导瘫痪的操作过程。在中枢神经系统中，活化的Th17细胞与表达水通道蛋白-4的星形胶质细胞相互作用，引发免疫反应，导致小鼠出现尾部和肢体瘫痪。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

购入8周龄的C57BL/6（H-2^b）雌性小鼠，C57BL/6 AQP4^-/-小鼠由A. Verkman提供。

1. 使用 AQP4 多肽免疫小鼠

1. 制备完全弗氏佐剂（CFA）工作液。​
   1. 使用研钵和研杵将干燥的结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，H37Ra）充分研磨成细粉。
   2. 将研磨后的 H37Ra 加入不完全弗氏佐剂中，终浓度为 4 mg/mL。CFA 可在 4 °C 下保存最多 6 个月。
2. 将冻干的抗原（Ag）AQP4 肽溶解于磷酸盐缓冲液（PBS）中，终浓度为 1 mg/mL。保存于 4 °C 或冰上。
3. 准备由两个带鲁尔锁扣的注射器通过三通阀连接组成的装置，用于盛装 CFA/肽乳化液。
   1. 将一个无活塞的玻璃鲁尔锁扣注射器连接至带有两个雄性鲁尔锁扣接口的三通尼龙阀上。通过将阀门手柄转向注射器方向将其关闭。将注射器开口端朝上放置，使其起到试管的作用。将其置于试管架中以增加稳定性。
   2. 涡旋混匀 CFA 工作液和抗原溶液。按 1:1 体积比将肽溶液与 CFA 加入敞开的注射器中。每只小鼠需要 200 µL 的 CFA/Ag（4 × 50 µL）。
      注意：通常约有 1 mL 的混合液会残留在三通阀中，从而减少可用于免疫接种的液体量。因此，在计算所需总体积时必须将此损耗考虑在内。
      示例：免疫 5 只小鼠所需总量 = (200 µL/只 × 5 只) + 1 mL 额外体积 = 共需 2 mL CFA/Ag。
   3. 将玻璃活塞插入注射器中，并固定活塞位置，然后将整个装置倒置，使三通阀朝上。将三通阀手柄切换至未使用的雌性接口。轻轻推动玻璃活塞以排出注射器中的多余空气，使液体充满三通阀的第二个雄性鲁尔锁扣接口。
   4. 将第二个玻璃注射器（活塞完全插入）连接至三通阀的另一个雄性鲁尔锁扣接口。整个系统应是由两个玻璃注射器通过三通阀连接而成的密闭系统，尽可能减少残留空气。
   5. 为形成乳化液，交替推动两个注射器的活塞，使液体在两个注射器之间来回转移约 2 分钟。将注射器置于冰上冷却约 10 分钟。重复冷却和混合操作，直至制剂黏度发生明显变化，形成质地坚硬、呈乳白色的乳化液。将含有乳化液的注射器置于 4 °C 冰箱中冷藏或保持在冰上。
4. 将全部乳化液转移至其中一个玻璃鲁尔锁扣注射器中，取下空的玻璃注射器，并替换为 1 mL 鲁尔锁扣注射器用于注射。用乳化液填充新注射器，从三通阀上取下，安装针头（25G × 5/8）。
5. 进行“水测试”以检测乳化液的一致性。将一滴乳化液挤入盛有少量水的小培养皿中。乳化液不应扩散，表明其适合注射。
   1. 若乳化液发生扩散，则说明尚未准备好，需将液体重新转移回玻璃注射器中，继续混合并再次冷却，直至乳化液变得坚硬。
   2. 重复测试，直至达到合适的稠度。
6. 对供体 AQP4^-/- 小鼠皮下（s.c.）注射含有 AQP4 肽的乳化液。每只小鼠接受 4 次皮下注射（每次 50 µL，共 200 µL，含 100 µg 肽），注射部位包括下腹部两侧（引流至腹股沟淋巴结）以及胸部两侧腋窝内侧（引流至腋下淋巴结）。每只受体小鼠进行过继转移时需使用 1–2 只免疫过的供体小鼠。

2. T细胞培养与促炎性T细胞极化

1. 免疫后10-12天，采集小鼠淋巴结。
   1. 在冰盒中，准备60 mm培养皿，内置70 µm孔径的细胞筛，并加入含10%热灭活胎牛血清（FBS）和100 U/mL青霉素-100 µg/mL链霉素（pen-strep）的预冷RPMI（Roswell Park Memorial Institute）培养基（RFPS）。
   2. 通过暴露于CO₂处死小鼠₂，随后实施颈椎脱位。将小鼠浸入70%乙醇中，然后将每只足垫固定于解剖板上。
   3. 从腹股沟至颈部沿中线切开皮肤，并沿每条腿向下切开。将皮肤从腹膜剥离并紧绷地固定在解剖板上。解剖腹股沟和腋窝淋巴结，放入含有RFPS并置于冰上的培养皿中。
   4. 在过继转移实验中，将同一免疫组内所有动物的淋巴结合并。对于Vβ使用情况的流式细胞分析，需分离各单个动物的淋巴结。
2. 将含有淋巴结的细胞滤网置于装有RFPS的50 mL离心管上。用无菌5 mL注射器活塞的平端压挤淋巴结组织，使细胞通过滤网，并用20–30 mL RFPS冲洗，以促进细胞回收。在处理过程中直至培养前，均应将淋巴结细胞置于冰上保存。
3. 洗涤两次，每次以393 x g离心 g 5分钟。第二次洗涤后，将淋巴结细胞重悬于T细胞培养基（TCM）中。TCM含有添加了10%热灭活胎牛血清、292 µg/mL L-谷氨酰胺、110 µg/mL丙酮酸钠、55 µM 2-巯基乙醇和青霉素-链霉素的RPMI培养基。通常每只供体小鼠使用5 mL TCM。
4. 计数淋巴结细胞。预期产量约为 3-6 x 10⁷ 每只免疫小鼠供体的淋巴结细胞数
5. 建立用于过继性转移的极化培养物。
   1. 准备5 x 10⁶的Th17极化培养体系⁶ 每毫升含 LN 细胞，加入 10 µg/mL 抗原、20 ng/mL 重组小鼠白细胞介素（IL）-23 和 10 ng/mL 重组小鼠 IL-6 的 TCM 培养基。
   2. 或者，对于Th1极化，准备5 x 10⁶个细胞的培养⁶ 每毫升含 LN 细胞，加入 10 µg/mL 抗原和 10 ng/mL 重组小鼠 IL-12 的 TCM。
   3. 加入2 mL（1 × 10⁷ 每孔加入极化培养混合物中的细胞，接种至12孔板中。2-4只供体小鼠的LN细胞可填满一块12孔板。将培养物置于37 °C、5% CO2的湿润培养箱中培养72小时。
   4. 在培养后48小时和72小时，通过显微镜观察淋巴结细胞的活化情况。活化的细胞将形成大量细胞簇，T细胞体积增大，形态更加多形性。代谢增强将导致培养基pH下降，颜色由桃色变为橙色。若pH过低使培养基变为黄色，需加入1 mL新鲜TCM，以防止在后续24小时内对细胞产生毒性。
   5. 进行过继性转移。

3. 过继性转移致病性AQP4特异性T细胞

注意：此步骤接续第 2.5 节：T 细胞培养与促炎性 T 细胞极化。

1. 用移液枪反复吹打12孔板中的极化细胞，使其脱离，收集至50 mL离心管中。注射前将细胞置于冰上保存。
2. 计数细胞，用预冷的PBS洗涤两次，然后以PBS配制成浓度为1 × 10⁸ 个细胞/mL的悬液。通常在1小时内完成注射。
3. 注射时轻轻旋转混匀细胞，转移至1 mL注射器中。通过尾静脉向每只小鼠静脉注射（i.v.）200 µL细胞悬液（含2 × 10⁷ 个细胞）。
4. 在当天及两天后，分别向每只受体小鼠腹腔注射（i.p.）200 µL PBS稀释的200 ng B. pertussis 毒素。每日观察小鼠临床疾病症状。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
M. tuberculosis H37Ra	BD Difco	231141	冻干、灭活的 M. tuberculosis
不完全弗氏佐剂	BD Difco	263910
AQP4 肽段 p135-153	Genemed	定制合成	肽段序列：LVTPPSVVGGLGVTMVHGN
AQP4 肽段 p201-220	Genemed / Auspep	定制合成	肽段序列：HLFAINYTGASMNPARSFGP
MOG 肽段 p35-55	Genemed / Auspep	定制合成	肽段序列：MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK
三通旋塞阀	Kimble	420163-4503
HyClone 胎牛血清（经鉴定）	GE Healthcare Life Sciences	SH30071
重组小鼠 IL-23	R&D Systems (BioTechne)	1887-ML
重组小鼠 IL-6	R&D Systems (BioTechne)	406-ML
重组小鼠 IL-12	R&D Systems (BioTechne)	419-ML
百日咳博德特氏菌来源的百日咳毒素	List Biological Laboratories	181
可调流速蠕动泵	Fisher Scientific	13-876-2